楊石磊，黃峰※，晁旭，馮雪松

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室，陜西 咸陽 712046）

肝硬化是肝纖維化的最終階段，是眾多慢性肝病轉歸的重要節(jié)點。全世界每年約有200 萬人因各類肝病而死亡，這其中又有約100 萬人死于肝硬化導致的諸如大出血、腹水等并發(fā)癥，如今肝硬化是排在全球第11 位最常見的死亡原因，給人類健康帶來巨大威脅[1]。目前，西醫(yī)對于肝硬化的治療并不理想，主要是病因治療，晚期治療的唯一選擇只有肝移植[2]。中醫(yī)藥在治療肝硬化方面具有獨特優(yōu)勢，已有臨床研究顯示[3]，既往是否聯(lián)合中醫(yī)藥治療，是影響肝硬化預后轉歸的重要因素。此外，研究顯示[4]，中醫(yī)藥在降低肝硬化患者肝癌發(fā)生率、提高肝硬化患者5 年生存率和預防肝硬化食管胃靜脈曲張破裂出血等方面具有顯著療效。從中醫(yī)角度來看，肝硬化可以按癥瘕積聚、腫脹和黃疸等來論治[5]，病機為血瘀絡阻，在治療上，應重視活血化瘀通絡[6]。桂枝茯苓丸是《金匱要略》中的經(jīng)典名方，有活血化瘀、緩消癥塊之功，原方主要用于治療婦女瘀阻胞宮諸癥。根據(jù)中醫(yī)“方證相應”理論以及肝硬化的臨床表現(xiàn)，肝硬化的病機和癥候都符合桂枝茯苓丸的方證要點[7]。趙玉瑤等[8]以桂枝茯苓丸為基礎方治療代償期肝硬化32 例，取得良好效果，但目前缺少大樣本臨床研究，且機制尚不明確。

網(wǎng)絡藥理學綜合了計算機信息學與系統(tǒng)生物學，從藥物－靶點－疾病－基因層次來解釋藥物對疾病的作用機制，這與中藥復方治療疾病的多成分、多靶點理論有異曲同工之處，十分符合中醫(yī)“異病同治”、“同病異治”的觀點[9]。分子對接技術可以進一步對篩選后的核心成分與核心靶點進行驗證，以評估兩者的結合潛力。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法，分析桂枝茯苓丸的有效成分，預測潛在作用靶點，探討其在治療肝硬化中的潛在機制，為后續(xù)的研究提供初步理論基礎。

1 資料與方法

1.1 桂枝茯苓丸中活性成分與靶點的收集

選取TCMSP（https://tcmspw.com/index.php ）[10]、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）[11]和HERB（http://herb.ac.cn/）[12]等多個數(shù)據(jù)庫，分別以桂枝、茯苓、桃仁、赤芍和牡丹皮為關鍵詞檢索獲取桂枝茯苓丸中的活性成分，再進行數(shù)據(jù)合并以及去除重復項；并以口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18 為條件[13]篩選活性成分。先用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對活性成分的作用靶點進行預測，若該數(shù)據(jù)庫中某活性成分無對應靶點，再用ETCM 與HERB 數(shù)據(jù)庫進行補充。將收集到的靶點用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）設定“Reviewed”和“Human”為限定條件，對該靶點所對應的基因名稱進行標準化處理[14]。

1.2 肝硬化疾病靶點收集

以“cirrhosis”為關鍵詞，分別在Genecards（https://www.genecards.org/）[15]、OMIM（https://www.omim.org/）[16]和TTD（http://db.idrblab.net/web/）[17]疾病基因數(shù)據(jù)庫進行檢索，將檢索結果利用EXCEL 合并后去除重復值。

1.3 藥物－疾病共有靶點篩選

將桂枝茯苓丸活性成分靶點與肝硬化疾病取交集靶點，構建Venn 圖（http：//www.bioinformatics.com.cn/），得到桂枝茯苓丸治療肝硬化的靶點。

1.4 構建活性成分－靶點網(wǎng)絡及分析

運用Cytoscape 3.9.1[18]構建桂枝茯苓丸“活性成分－靶點”網(wǎng)絡和分析，利用其內置Network Analyzer分析工具分析網(wǎng)絡具體數(shù)據(jù)，包括連接度（Degree）、緊密度（Closeness centrality,CC）和介度（Betweenness centrality,BC）等，研究藥物活性成分與其靶點之間的關系。

1.5 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡圖構建

利用STRING（https://cn.string-db.org/）[19]數(shù)據(jù)庫，將物種設定為Homo sapiens，并設置minimum required interaction score ＞0.70，刪除游離作用靶點，構建蛋白相互作用網(wǎng)絡（PPI）。再將后臺數(shù)據(jù)下載，利用Cytoscape 3.9.1 處理，得到桂枝茯苓丸治療肝硬化潛在靶點蛋白相互作用可視圖。

1.6 生物信息學分析

將所獲得的交集靶點錄入Metascape 數(shù)據(jù)平臺（https：//metascape.org）[20]，將條件設置為P<0.01，進行GO 功能分析與KEGG 通路富集分析，保存后臺結果，并用微生信分析平臺（http：//www.bioinform atics.com.cn）對后臺結果進行可視化分析。

1.7 分子對接

選擇在桂枝茯苓丸“活性成分－靶點”網(wǎng)絡中degree排名前6 位的核心活性成分，以及PPI 網(wǎng)絡中degree排名前6位的靶點基因分別進行分子對接。從PubChem數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取核心活性成分小分子配體2D 結構，再轉化為3D 結構并另存為SDF 格式，隨后利用Open Babel 3.1.1 通過MMFF94 力場優(yōu)化小分子能量，將SDF 轉化為PDB格式，最終通過AutoDock Tools 1.5.7[21]得到核心活性成分的PDBQT 格式文件。從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）[22]獲取PPI 網(wǎng)絡中相互作用靶點基因的3D 結構，用Discovery Studio 2021 去除小分子配體及水分子，得到靶點基因的PDBQT 格式文件。利用AutoDock Tools1.5.7 將上述得到的結果進行分子對接驗證，最終對接結果用Discovery Studio 2021 進行可視化處理。

2 結果

2.1 桂枝茯苓丸活性成分與靶點篩選

綜合多個數(shù)據(jù)庫，共獲得桂枝茯苓丸有效成分56個，其中桂枝、茯苓、桃仁、赤芍和牡丹皮分別有4、12、16、14 和6 個特有成分；以及茯苓和桃仁共有成分1個，桂枝、桃仁和赤芍共有成分1 個，桂枝、赤芍和牡丹皮共有成分2 個（表1）。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共獲得作用靶點638 個，其中桂枝74 個、茯苓30 個、桃仁139個、赤芍158 個和牡丹皮237 個。結合ETCM、HERB數(shù)據(jù)庫進行補充，共收集到桂枝茯苓丸中活性成分的相關作用靶點690 個。再利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行基因統(tǒng)一標準化處理，并經(jīng)過EXCEL 合并去重后，最終獲得桂枝茯苓丸中活性成分的標準基因靶點270 個。

表1 桂枝茯苓丸有效成份Table 1 Guizhifuling Pill active ingredient

2.2 肝硬化疾病靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得肝硬化疾病靶點5224個，將其Relevancescore利用EXCEL通過2 次MEDIAN（中位數(shù)）函數(shù)篩選后獲得靶點1 305 個。OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得靶點10 個，TTD數(shù)據(jù)庫獲得肝硬化靶點5 個。利用EXCEL 合并、去除重復靶點，最終獲得1 309 個肝硬化疾病靶點。

2.3 桂枝茯苓丸活性成分與肝硬化共有靶點

將桂枝茯苓丸活性成分的270 個靶點與肝硬化的1 309 個疾病靶點通過Venn 圖取交集，共獲得共有靶點121 個，這些靶點可以視為桂枝茯苓丸治療肝硬化的關鍵靶點，見圖1。

圖1 桂枝茯苓丸活性成分與肝硬化的交集靶點Venn 圖Fig.1 Venn diagram of the intersecting targets of the active ingredients of Guizhifuling Pill and liver cirrhosis

2.4 桂枝茯苓丸“活性成分-靶點”網(wǎng)絡構建和分析

運用Cytoscape 3.9.1 構建桂枝茯苓丸活性成分與其作用靶點網(wǎng)絡，圖中包含331 個節(jié)點，753 條邊，六邊形節(jié)點代表藥物活性成分，菱形節(jié)點代表作用靶點；若節(jié)點越大、透明度越低，則說明其degree（連接度）越大，見圖2。再將活性成分具體數(shù)據(jù)利用EXCEL根據(jù)連接度進行排名，并綜合緊密度（Closenesscentrality,CC）與介度（Betweennesscentrality,BC）進行分析，最終得到綜合排名前10 的藥物活性成分節(jié)點為MDP01、B1、FL12、MDP03、A1、CS05、CS01、B3、CS02 和B2，見表2。

圖2 桂枝茯苓丸“活性成分－靶點”網(wǎng)絡圖Fig.2 Guizhifuling Pill"active ingredient-target"network

表2 桂枝茯苓丸核心活性成分Table 2 Guizhifuling Pill core active ingredients

2.5 蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建

將桂枝茯苓丸活性成分與肝硬化疾病共有的121個靶點采用STRING 數(shù)據(jù)庫構建PPI 網(wǎng)絡。網(wǎng)絡中包含121 個節(jié)點和845 條邊，平均degree 值為14。再將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.1 進行處理并形成可視化分析圖，其中若節(jié)點越大、顏色越深，則說明其degree（連接度）越大，在網(wǎng)絡中的作用也就越重要（圖3）。按degree 由高到低排序，排名前12 的靶點基因依次為：TNF、AKT1、TP53、IL6、CASP3、RELA、IL1B、EGFR、MYC、VEGFA、MMP9 和MAPK1，這些基因可能在桂枝茯苓丸治療肝硬化的機制中具有關鍵意義。

圖3 桂枝茯苓丸治療肝硬化PPI 網(wǎng)絡Fig.3 Guizhifuling Pill for cirrhosis PPI network

2.6 生物信息學分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)平臺對桂枝茯苓丸治療肝硬化的121 個核心靶點進行GO 富集分析。以P<0.01為條件，得出前10 條在生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）的條目，并作柱狀圖（圖4）。桂枝茯苓丸治療肝硬化在生物過程中主要涉及對活性氧的反應、對脂多糖的反應和對細菌來源分子的反應等，在細胞組成上主要涉及窖蛋白、質膜筏和膜筏等，在分子功能上主要涉及核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、轉錄核心調節(jié)器結合等，表明其分布于各種生物過程、分子組成與分子功能中。

圖4 桂枝茯苓丸治療肝硬化靶點GO 功能分析柱狀圖Fig.4 Histogram of GO function analysis of Guizhifuling Pill for cirrhosis

利用Metascape 數(shù)據(jù)平臺以P<0.01 為條件，根據(jù)KEGG 代謝通路富集分析結果，按P 值排序，獲得排名前20 條通路的氣泡圖，氣泡顏色代表P 值的大小，顏色越紅則P 值越小，氣泡大小表示通路中基因的數(shù)量，氣泡越大則基因數(shù)量越多（圖5）。并將前20條通路與其基因數(shù)據(jù)利用Cytoscape 3.9.1 進行可視化分析，得到通路－靶點網(wǎng)絡圖，圓形節(jié)點代表通路，菱形節(jié)點代表基因靶點。節(jié)點越大、透明度越低，說明其degree（連接度）越大（圖6）。最終得出桂枝茯苓丸治療肝硬化主要富集的通路為癌癥中的途徑、脂質和動脈硬化途徑、AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化途徑、乙型肝炎途徑、前列腺癌途徑、丙型肝炎途徑、人類巨細胞病毒感染途徑、卡波西肉瘤相關的皰疹病毒感染途徑、小細胞肺癌途徑、TNF 信號通路、IL-17 信號通路、麻疹途徑、非酒精性脂肪肝途徑、胰腺癌途徑、化學致癌-受體激活途徑、恰加斯病途徑、甲型流感途徑、結核病途徑和弓形蟲病途徑，表明桂枝茯苓丸的有效成分靶點通過調節(jié)不同通路對肝硬化起到治療作用。

圖5 桂枝茯苓丸治療肝硬化靶點KEGG 富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble map of KEGG enrichment analysis of the target of Guizhifuling Pill for the cirrhosis

圖6 桂枝茯苓丸治療肝硬化前20 條通路與其靶點基因網(wǎng)絡圖Fig.6 The first 20 pathways of Guizhifuling Pill for cirrhosis and its target gene network

2.7 分子對接

選取桂枝茯苓丸中排名前6 位的活性成分：槲皮素、β-谷甾醇、脫氫尿酸、山柰酚、常春藤皂苷元、黃芩素與PPI網(wǎng)絡中排名前6 位的靶點基因：TNF、AKT1、TP53、IL6、CASP3PRELA 分別進行分子對接，具體數(shù)據(jù)見表3。分子對接結合能數(shù)據(jù)用熱圖進行展示，結果見圖7。若對接結合能越低，則代表活性成分與靶點基因結合結構越穩(wěn)定，兩者之間相互作用的可能性也就越大。對接結果顯示，β-谷甾醇與AKT1、常春藤皂苷元與AKT1、脫氫尿酸與AKT1、黃芩素與AKT1 的對接結合能均小于 38 kJ/mol。其中，β-谷甾醇與AKT1的對接結合能僅為 45.61 kJ/mol，在36 組中最低，提示桂枝茯苓丸中的活性成分β-谷甾醇可能通過作用于AKT1 起到治療肝硬化的作用。將分子對接結合能最低的4 組結果作分子對接圖，見圖8。

圖7 活性成分與靶點基因對接結果熱圖Fig.7 Heat map of the docking results of active ingredients and potential targets

圖8 分子對接圖Fig.8 Molecular docking maps

表3 關鍵活性分子與靶點對接表Table 3 Docking of key active molecules and targets

3 討論

網(wǎng)絡藥理學可以初步揭示中藥方劑治療特定疾病的潛在作用機制。本研究通過網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法對桂枝茯苓丸的活性成分進行分析，得出連接度排名靠前的活性成分主要有槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素和(+)-兒茶素等，這些活性成分可能是桂枝茯苓丸治療肝硬化的核心活性化合物。其中，槲皮素可以通過調節(jié)細胞色素C 參與細胞凋亡途徑[23]，具有保肝、護肝功能，并且已有動物試驗表明其可能通過抑制TLR4/CXCL9/PREX-2 通路緩解肝硬化進程[24]。Kim 等[25]發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可通過減輕肝臟組織中膠原的累積以預防肝纖維化向肝硬化進一步轉變，而β-谷甾醇為桂枝茯苓丸中桂枝、赤芍和桃仁3 藥共有成分，更進一步證明了桂枝茯苓丸對肝硬化的治療作用。黃芩素已被證明在體外試驗中有抗肝纖維化作用[26]，Dong等[27]研究顯示，黃芩素可通過下調PERK 蛋白和上調Nrf2蛋白起到減輕肝臟氧化應激和細胞凋亡的作用。兒茶素及其衍生物可以通過調控MAPK、NF-κB 信號通路等發(fā)揮抗炎、保肝作用[28]，越來越多的研究證實，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及其下游信號在肝硬化疾病中起著重要調控作用[29]，而NF-κB 信號通路又是肝硬化發(fā)展過程中的重要信號通路。(+)-兒茶素為桂枝、赤芍和牡丹皮3 種藥共有成分，在酒精性脂肪肝動物模型中，(+)-兒茶素通過促進超氧化物歧化酶（SOD）的表達，以減少血清中甘油三酯與轉氨酶含量，最終修復小鼠的肝臟損傷[30]。

通過PPI 得出桂枝茯苓丸治療肝硬化的靶點基因有腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor,TNF）、蛋白激酶1（Protein kinase 1,AKT1）、白細胞介素6（Interleukin 6,IL6）、天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase 3,CASP3）、血管內皮細胞生長因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1）等。TNF-α和IL-6 是具有協(xié)同作用的促炎癥因子，已被證實是乙肝患者向肝硬化進展的關鍵因素[31]。肝臟細胞凋亡與CASP3 的活性有著密切關系，TNF/TNFR1 復合物可以激活CASP3 的下游因子，這對肝硬化的進展具有重要影響[32]。AKT是PI3K信號通路的下游因子，PI3K信號通路可激活多種炎癥反應，進而通過炎癥反應參與肝硬化的發(fā)生[33]。從圖7 中可看出，在36 組分子對接驗證中，AKT 與6 個核心活性成分的對接結合能均小于 38 kJ/mol，顯示出較強的結合活性，為深入挖掘桂枝茯苓丸治療肝硬化的作用機制提供了方向。血管生成在慢性肝病中起著重要作用，肝星狀細胞可以通過表達VEGFA 誘導血管生成[34]，從而促進肝硬化進程。MAPK1 作為MAPK 家族成員之一，具有調節(jié)肝臟細胞增殖、分化及死亡的功能，可以通過影響炎性細胞黏附血管內皮增殖促進肝硬化的發(fā)生[35]。

通過分析KEGG 代謝通路富集得出的排名前20條的通路，在排除與肝硬化明顯不相關的通路后，發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路或IL-17 信號通路可能是桂枝茯苓丸治療肝硬化的潛在信號通路。研究顯示[36]，AGE 可與RAGE 結合，作用于NF-κB信號通路，引起IL-1 等炎性因子產(chǎn)生，促進肝臟中纖維化因子形成與膠原蛋白累積，逐步由肝纖維化發(fā)展為肝硬化。在TNF 信號通路相關機制研究中，盡管TNF-α會促進肝硬化的發(fā)展程度，但在特定濃度下，TNF-α對四氯化碳誘導的急性肝損傷有明顯的保護作用，其作用機制可能與TNF-α進一步激活了Bcl-XL、FHC、XIAP 和Bcl-2 等抗凋亡基因有關[37]，TNF 信號通路的雙重作用仍需進一步研究。有臨床觀察發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，肝硬化患者的血清中IL-17 明顯增高，并且IL-17 水平與患者的轉氨酶水平呈正相關關系[38]。IL-17 信號通路可以通過上調p38MAPK 和ERK 1/2的方式促進IL-6 產(chǎn)生[39]，或激活STAT 3 信號通路直接誘導肝星狀細胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原[40]。綜上所述，桂枝茯苓丸可通過作用于多個靶點并通過多種機制和調節(jié)多條信號通路發(fā)揮其抗肝硬化的作用。

4 結語

本研究為進一步挖掘桂枝茯苓丸治療肝硬化的作用機制提供了一定的理論依據(jù)。目前，研究缺少對桂枝茯苓丸治療肝硬化的直接報道，仍多集中于其他活血化瘀類方劑以及其5 味中藥組成所含化學成分的作用研究，這反映出對桂枝茯苓丸的挖掘并不夠深入及全面。利用網(wǎng)絡藥理學方法研究中藥方劑治療特定疾病的作用機制仍有一定的局限性，如現(xiàn)有藥物、疾病數(shù)據(jù)庫收錄信息不全等，本文的研究結果仍處于理論階段，還需與臨床及藥理試驗相結合進行深入研究。