焉學倩，鞏金壯，何建暄，王英平,2，張 瑞,2※

（1.吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 132118；2.國家作物種質資源長春觀測實驗站，吉林 長春 132118）

關鍵字：北細辛；產地加工；鎮(zhèn)痛

細辛為馬兜鈴科植物北細辛[Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.]、漢城細辛（Asarum sieboldii Miq.var.seou1ense Nakai）或華細辛（Asarum sieboldii Miq.）的干燥根和根莖，前2種習稱“遼細辛”[1]。細辛首載于《神農本草經》，被列為上品，是常用中藥[2]。細辛性溫，味辛，具有溫肺化飲、祛風散寒、通竅和止痛的功效，主治風寒感冒、頭痛、痰飲、咳喘、鼻塞、牙痛及風濕痹痛[1,3]。古今文獻均記載細辛藥用部位為其根部。南北朝《本草經集注》載有“用之去其頭節(jié)”，即除去其根莖蘆頭部位。雷敩《雷公炮炙論》中記載“凡使，一一揀去雙葉，服之害人”[4]。雷敩提出細辛葉對人有害，并提出要除去頭節(jié)，說明當時醫(yī)家已發(fā)現(xiàn)細辛的地上部位毒性較大，故將其除去?！吨袊幍洹?020 版[1]規(guī)定細辛的主要藥用部位為根及根莖，與傳統(tǒng)記載不符[5]。

本研究以花期采集的細辛樣品為研究對象，研究不同去蘆長度對北細辛揮發(fā)油、細辛脂素、總灰分和酸不溶灰分等指標的影響，并對最佳切制工藝基礎上的北細辛進行鎮(zhèn)痛效果的藥效學評價。賈凌云等[6]研究不同產地及不同采收期的細辛揮發(fā)油和甲基丁香酚的含量，結果表明，揮發(fā)油含量在9 月份達到最高。蔡少青等[7]研究不同年份及采集時間對北細辛揮發(fā)油的影響，結果顯示，總揮發(fā)油含量在4、5 和9 月含量最高，本研究前期試驗結果顯示揮發(fā)油含量在7、8 和9 月份含量最高但無顯著性差異，故本試驗選擇7 月27日采集的果后期北細辛作為鎮(zhèn)痛效果的研究材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取6 年生北細辛樣品，采自于吉林省通化市柳河縣五風輪村（東經125°37'56''，北緯41°97'5''）北細辛規(guī)范化種植基地，每個采樣點2 m2，將每5 個采樣點采集的北細辛混合，作為一個重復，一共3 個重復。北細辛經吉林農業(yè)大學中藥材學院王志清副教授鑒定為馬兜鈴科植物北細辛[Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag]。北細辛飲片購買自龍康藥業(yè)有限公司。

試驗動物品種品系為KM 小鼠，雄性，繁殖方式為封閉群，微生物等級為SPF 級，體重（20±2）g，購自于長春生物制品研究所有限責任公司，試驗動物使用許可證號：SCXK（吉）-2017-0005；飼養(yǎng)于吉林農業(yè)大學動物實驗研究中心，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，自由飲水，12 h 光照，標準飼料喂養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 采收后將北細辛沖洗干凈，自細辛根部密集處向下分別切除蘆頭0.5cm、1.0cm和1.5cm，趁細辛新鮮時切制稱為鮮切，將細辛陰干后切制稱為干切。

1.2.2 樣品的制備 采用煎煮法，取北細辛藥材粉碎過2 號篩，取50 g 加10 倍量的蒸餾水浸泡30 min，文火煎煮45 min，四層紗布過濾得濾液A，濾渣加8倍量的蒸餾水，文火煎煮30 min，四層紗布過濾得濾液B，合并2 次水煎液，高速冷凍離心機離心10 min，取上清液于真空冷凍干燥機冷凍干燥成凍干粉，備用。

對照品的制備稱取0.100 g 阿司匹林藥片，溶于蒸餾水中，用容量瓶定容至100 mL，備用。

1.2.3 總揮發(fā)油含量的測定 分別稱取不同采收期的細辛粉末20 g（精確至0.01 g），記為X1，置于1 000 mL 的圓底燒瓶中，加蒸餾水400 mL，玻璃珠數(shù)粒，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器和回流冷凝管。電熱套加熱至沸騰，并保持微沸5 h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，按照規(guī)定讀取揮發(fā)油體積讀數(shù)為X2，計算揮發(fā)油的含量%，記為Y。計算公式為：Y=X2/X1×100%

1.2.4 總灰分的含量測定 總灰分的測定，參照《中國藥典》2020 版[1]，總灰分測定法。

1.2.5 酸不溶灰分的含量測定 酸不溶灰分的測定，參照《中國藥典》2020 版[1]酸不溶灰分測定法。

1.2.6 醇溶性浸出物的含量測定 醇溶性浸出物的測定，參照《中國藥典》2020 版[1]，醇溶性浸出物測定法。稱取過二號篩供試品粉末3 g 記為m1（g），精密稱定，置于錐形瓶中，加入95%的乙醇75 mL，密塞，稱重，靜置1 h，連接回流冷凝裝置，置于水浴上加熱致沸騰，保持微沸的狀態(tài)1 h。冷卻后，用95%的乙醇補足減失的重量，混合均勻，過濾，量取25 mL 置于恒重的蒸發(fā)皿中，蒸發(fā)皿重記為m0（g），水浴蒸干后，放置于105 ℃的電熱鼓風干燥箱中干燥3 h，于干燥器中干燥0.5 h，迅速精密稱定重量記為m2（g），計算浸出物的含量（%）記為Y。計算公式為：Y=[（m2－m0）×100]/25 m1×100%

1.2.7 北細辛細辛脂素的含量測定 細辛脂素的測定，參照《中國藥典》2020 版的方法[1]。標準曲線的制備：取制備好的對照品溶液（50μL、11μL、14μL、17μL 及20μL。以峰面積為縱坐標，細辛脂素的進樣量（μg）為橫坐標，計算得回歸方程為：y=97.083 1x 76.029 1（相關系數(shù)R2=0.999），線性范圍0.4～1μg。

圖1 液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram

1.2.8 熱板試驗 選擇雄性KM 小鼠置于溫度設定為55.0 ℃的智能熱板儀上，以小鼠出現(xiàn)舔后足、跳躍反應為指標，記錄小鼠在熱板上首次出現(xiàn)的時間為痛反應潛伏期。試驗前30 min 測定2 次，潛伏期取平均值作為基礎閾值（baseline latency,BL），取潛伏期在5～15 s 內的小鼠，將小鼠隨機分組，每組10 只。設生理鹽水對照組（NS，20 mL/kg）、阿司匹林陽性對照組（0.02 g/kg），6 年生北細辛（生藥量2 g/kg）及市場細辛提取凍干粉均用娃哈哈純凈水溶解成混懸液。測定給藥后30 min、60 min、90 min 和120 min 的痛閾值。超出60 s 的按60 s 記，記錄數(shù)據(jù)[8]。公式如下：

1.2.9 醋酸扭體試驗 選擇雄性小鼠，隨機分4 組，每組10 只，設生理鹽水對照組（NS，20 mL/kg）、阿司匹林陽性對照組（0.02g/kg）、6 年生細辛（生藥量2g/kg）與常規(guī)細辛提取液凍干粉，用娃哈哈純凈水溶解成混懸液。小鼠灌胃給藥35 min后，腹腔注射0.6%的醋酸（由高濃度到低濃度逐漸稀釋）0.2 mL。小鼠將有軀干伸張、腹部內凹和臀部抬高等扭體表現(xiàn)。注射醋酸后，記錄15 min內的扭體次數(shù)作為疼痛反應的指標[9]。公式如下：

2 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗過程中，每個試驗數(shù)據(jù)重復3 次，求平均值，得出數(shù)據(jù)采用Excel、DPS 9.01 統(tǒng)計軟件處理并進行差異性及相關性分析，字母標記法表示在5% 差異顯著性。

3 結果與分析

3.1 不同切制處理及干切、鮮切對北細辛揮發(fā)油含量的影響

對已去除地上部分的北細辛樣品，進行根部著生點向下分別切除0.5 cm、1.0 cm 和1.5 cm 的蘆頭，試驗通過不同切制長度，探究不同切制處理后對根部揮發(fā)油的含量影響。北細辛切制加工過程，切制后在根部會形成切斷面，通過檢測陰干后切制和趁鮮切制后揮發(fā)油的含量，比較鮮切和干切對揮發(fā)油含量的影響，并進行顯著性分析。由表1 可知，6 年生不同切制處理的北細辛揮發(fā)油的含量表現(xiàn)為切1.5 cm 處理根中揮發(fā)油含量最高，顯著高于切1.0 cm、0.5 cm 和未切制處理的。鮮切和干切細辛揮發(fā)油含量無顯著性差異。細辛蘆頭重量占比較大，通過前期試驗發(fā)現(xiàn)其蘆頭中揮發(fā)油含量較低，在花期其含量為0.33%，遠低于藥典中規(guī)定揮發(fā)油含量，所以在去除蘆頭后細辛須根中揮發(fā)油含量增加。

表1 6 年生不同處理的細辛揮發(fā)油差異性分析Table 1 Analysis on the difference of volatile oil of of 6 years old with different treatments

表1 6 年生不同處理的細辛揮發(fā)油差異性分析Table 1 Analysis on the difference of volatile oil of of 6 years old with different treatments

注：字母不同表示有顯著性差異，字母相同表示無顯著性差異（P ＜0.05）。Note:Different letters in the same line indicate that the difference is significant at the level ＜0.05.

3.2 不同切制處理的細辛對總灰分含量的影響

由圖2 可知，6 年生北細辛經切制處理后總灰分的含量發(fā)生了顯著變化，未切制處理總灰分含量最高顯著高于切制處理。切1.0 cm 和切1.5 cm 的總灰分含量最低，顯著低于未切制和切0.5 cm處理，切1.0 cm和切1.5 cm 無顯著性差異。細辛是須根植物，生長年限越多夾雜的泥沙越多，經切制處理后取出了蘆頭部分可以減少泥沙的夾雜，使灰分減少，切1.0 cm 基本把細辛蘆頭切掉只剩須根部分，所以切1.5 cm 與切1.0 cm 總灰分無顯著性差異。

圖2 6 年生細辛不同切制處理的細辛根部總灰分的影響Fig.2 Effect of different cutting treatments on the total ash content of 6 years old root

3.3 不同切制處理的細辛對酸不溶灰分含量的影響

由圖3 可看出，6 年生北細辛經切制處理后酸不溶灰分的含量發(fā)生了顯著變化，未切制處理酸不溶灰分含量最高，與切0.5 cm處理無顯著性差異，切1.0 cm和切1.5 cm 處理酸不溶灰分含量顯著低于未切和切0.5 cm 處理，切1.0 cm 處理與切1.5 cm 處理酸不溶灰分無顯著性差異。

圖3 6 年生細辛不同切制處理的細辛根部酸不溶灰分的影響Fig.3 Effects of different cutting treatments on acid insoluble ash content of 6 years old root

3.4 不同切制處理的細辛對細辛脂素含量的影響

細辛脂素對病毒和結核桿菌具有良好的拮抗作用，細辛脂素是細辛的指標成分之一。由圖4 可知，6年生北細辛經切制處理后細辛脂素發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)出未經切制處理的細辛脂素的含量最低，顯著低于切制處理。切1.0 cm 和切1.5 cm 處理細辛脂素含量顯著高于未切和切0.5 cm處理，二者無顯著性變化。切制處理減少細辛雜質的含量，由于去除了蘆頭，據(jù)前期研究表明蘆頭部分細辛脂素含量顯著低于細辛須根部分。在花期細辛脂素在蘆頭含量為0.09%，須根部分含量為0.14%，所以切制處理后細辛脂素含量升高。

圖4 6 年生細辛不同切制處理對細辛脂素的影響Fig.4 Effects of different cutting treatments of 6 years old on asarum lipids

3.5 6年生北細辛不同切制長度醇溶性浸出物含量差異

由圖5 可知，6 年生北生細辛經切制處理后醇溶性浸出物的含量發(fā)生了顯著變化，切1.5 cm的含量最高，切1.0 cm處理北細辛根醇溶性浸出物的含量高于未切組和切0.5 cm 處理，未切組和切0.5 cm 組無顯著性差異。

圖5 6 年生不同處理的北細辛醇溶性浸出物的影響Fig.5 The content difference of alcohol-soluble extract of 6 years old chinensis with different treatments

3.6 不同采收期6年生北細辛與市場售細辛水煎劑對熱刺激痛的影響

對果后期北細辛及市場售北細辛進行水煎劑的制備，利用智能熱板儀對小鼠進行致痛，比較不同細辛水煎劑對小鼠疼痛的作用效果。表2 結果表明，2 種細辛水煎劑對不同時間檢測的小鼠痛閾值均有明顯的提高，各給藥組的痛閾值均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。30 min 時痛閾提高速率較緩，鎮(zhèn)痛效果不佳。各給藥組在給藥后90 min 時痛閾值達到峰值，藥效發(fā)揮至最佳，120 min 時痛閾值顯著下降。不同時間段均顯示果后期的北細辛在小鼠熱板試驗中鎮(zhèn)痛效果最佳。

表2 細辛水煎劑對熱板引起小鼠疼痛模型的影響（）Table 2 Effect of decoction on pain model induced by hot plate in mice ()

表2 細辛水煎劑對熱板引起小鼠疼痛模型的影響（）Table 2 Effect of decoction on pain model induced by hot plate in mice ()

注：同一列字母不同，差異顯著（P ＜0.05）。Note:different letters in the same line indicate that the difference is significant at the level (P ＜0.05).

3.7 不同采收期6年生細辛與市場售細辛鎮(zhèn)痛抗炎的效果

檢測果后期北細辛與市場售北細辛水煎劑對醋酸引起的小鼠扭體反應的抑制作用效果，見表3。試驗結果表明，不同細辛水煎劑給藥組均可減少醋酸導致的小鼠扭體次數(shù)，相比于生理鹽水組各給藥組對醋酸引起的疼痛反應均有抑制作用，有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。研究表明，2 種細辛水煎劑對小鼠扭體的抑制作用為果后期采集的北細辛效果最好，抑制率為30.67%，優(yōu)于市場售常規(guī)飲片。

表3 細辛水煎劑對醋酸引起小鼠疼痛模型的影響（)Table 3 Effects of decoction on acetic acid-induced pain model in mice ()

表3 細辛水煎劑對醋酸引起小鼠疼痛模型的影響（)Table 3 Effects of decoction on acetic acid-induced pain model in mice ()

注：同一列字母不同，差異顯著（P ＜0.05）。Note:Different letters in the same line indicate that the difference is significant at the level(P ＜0.05).

4 討論

中藥材中富含蛋白質、多酚以及糖類等親水性大分子，水分含量過高容易導致中藥材發(fā)生霉變，影響中藥材的質量，而灰分含量可反映藥材的潔凈程度及金屬礦物質水平[10,11]。《中國藥典》2020 版[1]規(guī)定細辛水分的含量不得過10.0%，總灰分不可超過12.0%，酸不溶灰分不得超過5.0%，醇溶性浸出物不可少于9.0%，細辛脂素的含量不少于0.05%，揮發(fā)油不得少于2.0%[1]。規(guī)定同為根和根莖入藥的玉竹藥材總灰分含量不得超過3.0%，人參中總灰分的含量不得超過5.0%，由此可見，細辛中總灰分的含量較人參和玉竹等藥材高，雜質含量的高低影響藥材質量。總灰分是藥材經過高溫灼燒殘留的無機物，酸不溶性灰分主要是不溶于稀鹽酸的硅酸鹽類化合物[12]?；曳趾退岵蝗苄曰曳种饕退幉闹袏A雜的泥土砂石有關[13]。為改善藥材的質量，對北細辛藥材加工參數(shù)進行優(yōu)化，試驗數(shù)據(jù)表明，切制處理后的北細辛總灰分的含量顯著下降，其中切除蘆頭1.0 cm 和1.5 cm 的細辛總灰分含量顯著低于未切處理和切0.5 cm 處理的，符合預期。綜合各項檢測指標以及切制后北細辛根部得率，減少藥材損失，選擇切除蘆頭1.0 cm 為最佳切制處理，以保證加工后的經濟效益。

研究表明，藥材經采集凈制后進行鮮切處理，在根部形成了切斷面進行陰干，或者北細辛藥材經陰干后再進行切制處理，兩種方式處理后的北細辛對揮發(fā)油的含量無顯著性影響，說明切制鮮品北細辛形成的斷面不會造成揮發(fā)油明顯的損失。經不同切制長度處理的北細辛揮發(fā)油的含量存在顯著性差異，隨著北細辛的生長蘆頭部分包裹較多的雜質及泥沙較難清洗干凈，相同提取條件下切制長度的不同導致灰分含量不同從而影響了揮發(fā)油、細辛脂素以及醇溶性浸出物的含量，蘆頭部分揮發(fā)油、細辛脂素、醇溶性浸出物的含量較根低，亦或是北細辛自蘆頭向下成分的分布存在差異，根系分泌物和代謝產物存在差異有待進一步研究。

在最佳切制工藝下，與市售細辛飲片水煎劑進行鎮(zhèn)痛效果的對比研究結果顯示，經切制處理后的北細辛飲片較市場售細辛飲片鎮(zhèn)痛效果佳，說明去蘆加工后的北細辛在成分和藥效上均優(yōu)于市場售常規(guī)飲片。