宋興超，孟金柱，趙園園，吳震洋，安清明

（銅仁學院農(nóng)林工程與規(guī)劃學院 貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州 銅仁 554300）

我國山羊遺傳資源較為豐富，貴州白山羊?qū)偃庥眯蛢?yōu)良地方山羊品種，該品種已被列入《貴州地方畜禽遺傳資源志》《中國畜禽遺傳資源志羊志》和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部最新頒布的《國家畜禽遺傳資源目錄》[1,2]，因其具有抗逆性強、耐粗飼、肉質(zhì)細嫩、膻味輕和肉味鮮美等優(yōu)點，深受消費者喜愛，但該品種存在屠宰率低、凈肉率低及生長速度較慢等缺點[3]，限制了地方山羊品種養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。在保證地方品種原有優(yōu)質(zhì)特點的前提下，如何提高其生長速度和成年體重是目前貴州地方山羊品種改良及山羊產(chǎn)業(yè)規(guī)?；l(fā)展的一個關(guān)鍵核心問題，然而傳統(tǒng)育種方法周期長，遺傳進展緩慢且效果不顯著?；诜肿铀剑Y選山羊生長性狀的關(guān)鍵基因及相關(guān)分子標記，并進行標記輔助選擇育種，可加快肉用山羊品種選育的遺傳進展，同時也是改良貴州特色地方山羊品種的有效策略。

肌肉生長抑制素（Myostatin,MSTN）又稱生長與分化因子8（Growth and differentiation factors 8,GDF8），屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，是控制肌肉生長發(fā)育的重要負調(diào)控因子[4]，解除MSTN 基因的生長抑制功能是提高畜禽肌肉產(chǎn)量的一種有效途徑。小鼠MSTN基因被敲除后，可加快肌肉細胞增殖及增加骨骼肌含量，而過表達MSTN 基因小鼠的肌肉量明顯降低[5,6]。MSTN 基因第3 外顯子編碼的蛋白是MSTN 成熟肽部分，也是該基因的主要功能域。陳晨等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因第3 外顯子nt175～180 缺失突變使MSTN蛋白缺失一個蛋白結(jié)合位點，可導致小鼠出現(xiàn)肌肉肥大表型。鐘東明等[8]利用RACE 技術(shù)克隆了大刺鰍MSTN 基因全長cDNA 序列，其編碼蛋白的N 末端具有分泌必需的信號肽序列。Bi 等[9]檢測MSTN 基因5'UTR 存在5 bp 插入突變與內(nèi)蒙古白絨山羊胸深顯著相關(guān)（P=0.003）。

目前，牛、羊、豬、家禽及魚類等主要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物MSTN 基因序列已被相繼鑒定且該基因的變異可引起肌肉產(chǎn)量及肉質(zhì)性狀的變化，然而，目前鮮見貴州白山羊MSTN 基因分子結(jié)構(gòu)特性及其分子系統(tǒng)進化方面的相關(guān)報道。本研究以貴州白山羊MSTN基因為研究對象，應用比較基因組學方法對該基因編碼區(qū)核苷酸組成及蛋白結(jié)構(gòu)特性進行了相對全面的生物信息學預測與系統(tǒng)進化分析，旨在為進一步解析貴州白山羊肌肉發(fā)育相關(guān)候選基因及其調(diào)控肉質(zhì)性狀的遺傳機制提供借鑒與參考，同時也為貴州白山羊功能基因組學深入研究及特色山羊品種遺傳資源合理保護和利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 序列獲得

通過美國國家生物信息中心NCBI 網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Nucleotide 數(shù)據(jù)庫中篩查獲得貴州白山羊MSTN 基因（登錄號：EF588022）核苷酸序列。同時，下載與貴州白山羊相似性較高的綿羊（MH025940）、牛（JQ711180）、馬鹿（EF629535）、豬（AY208121）、家馬（KY746356）、人（NG-009800）、小家鼠（AY204900）、褐家鼠（NM-019151）、家犬（NM-001002959）、北極狐（AY606017）、赤狐（FJ966248）、貉（FJ966250）、家雞（NM_001001461）和綠頭野鴨（AF440861）MSTN 基因核苷酸與對應氨基酸序列。

1.2 分析方法

將下載的貴州白山羊MSTN 基因核苷酸序列導入在線軟件GENSCAN（http://genes.mit.edu/GENSCAN.html），預測該基因結(jié)構(gòu)組成。運用ExPASy（Expert Protein Analysis System）在線服務平臺ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）預測MSTN 基因編碼蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)理化參數(shù)。運行里昂大學法國國家科學研究中心開發(fā)的在線程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/），基于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分類識別（Discrimination of protein secondary structure Class,DSC）、多元線性回歸組合（Multivariate linear regression combination,MLRC）和PHD 方法分析MSTN 蛋白二級結(jié)構(gòu)，并參考Skolnick 等[12]判斷蛋白質(zhì)分類方法綜合預測其二級結(jié)構(gòu)類型。通過SignalP 4.1、TMHMM 2.0、Scratch Predict Protein 和NetPhos 3.1 在線軟件（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）分別預測貴州白山羊MSTN 蛋白潛在的信號肽、跨膜區(qū)、二硫鍵和磷酸化位點。利用CDART在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi?cmd=rps）、SMART軟件（http://smart.embl.de/）和Motif Scan 程序（https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan）分別分析貴州白山羊MSTN 蛋白結(jié)構(gòu)域和功能模體。利用DNASTAR Lasergene 17.3 軟件中MegAlign程序進行貴州白山羊與其他物種MSTN 基因核苷酸和編碼氨基酸的相似性分析；基于MEGA 5.0 軟件構(gòu)建貴州白山羊與其他物種MSTN 基因序列的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州白山羊MSTN基因結(jié)構(gòu)特點

MSTN 基因結(jié)構(gòu)分析表明，貴州白山羊基因包括完整的3 個外顯子、2 個內(nèi)含子及部分5′UTR（222bp），2 個內(nèi)含子均以“GT”開始，結(jié)束于“AG”；編碼序列（coding sequence,CDS）全長1 128 bp，起始密碼子為ATG，TGA 為終止密碼子，且其外顯子和內(nèi)含子堿基AT 含量均明顯高于GC，見表1。

表1 貴州白山羊μgene in Guizhou white goat

2.2 貴州白山羊MSTN蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

2.2.1 一級結(jié)構(gòu)理化參數(shù) 貴州白山羊MSTN 基因共編碼375 個氨基酸，由20 種常見氨基酸組成（表2），其中，亮氨酸（9.9%）含量最高，色氨酸（1.6%）含量最低，帶正電荷氨基酸（Arg+Lys）和帶負電荷氨基酸（Asp+Glu）均為48 個。ProtParam 在線軟件預測表明，貴州白山羊MSTN 蛋白化學分子式為C1912H3018N512O561S21，由6 024 個原子組成，分子質(zhì)量為42.827 35 ku，理論等電點（PI）為7.01，屬于弱堿性蛋白。貴州白山羊MSTN 蛋白不穩(wěn)定指數(shù)44.87，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)（計算指數(shù)＜40：穩(wěn)定，計算指數(shù)＞40：不穩(wěn)定）；脂肪族氨基酸指數(shù)為84.45；親水性總平均值（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為 0.411，初步推測該蛋白具有較強的親水性。

表2 貴州白山羊MSTN 蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of MSTN protein in Guizhou white goat

2.2.2 二級結(jié)構(gòu) 多種在線軟件綜合預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)表明，無規(guī)卷曲、延伸鏈和α-螺旋為貴州白山羊MSTN蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)，屬混合型二級結(jié)構(gòu)，見表3。

表3 貴州白山羊MSTN 蛋白二級結(jié)構(gòu)綜合分析Table 3 Comprehensive analysis of secondary structure of MSTN protein in Guizhou white goat

2.2.3 信號肽、跨膜區(qū)、二硫鍵與磷酸化位點分析 信號肽預測表明，C、Y 和S 分別表示原始剪切位點（Raw cleavage site）、綜合剪切點（Combined cleavage site）和信號肽（Signal peptide）的分值，當C 值較高且S 分值由高轉(zhuǎn)低的位點是典型信號肽的可能剪切點（圖1）。由圖1 可知，貴州白山羊MSTN 蛋白C 端存在1 段18 個氨基酸的潛在信號肽，剪切位點為第18～19 位氨基酸位點（…LVA-GPV…）。

圖1 貴州白山羊MSTN 蛋白信號肽分析Fig.1 Analysis of signal peptide for MSTN in Guizhou white goat

TMHMM 2.0 分析表明，貴州白山羊MSTN 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白。Scratch Protein Predictor 預測蛋白質(zhì)二硫鍵發(fā)現(xiàn)，13 個半胱氨酸殘基（Cys）中，10 個Cys共形成5 對二硫鍵，分別為：39～42、272～281、137～138、309～339 和313～340 位氨基酸。NetPhos 3.1 在線軟件分析（分值＞0.7）顯示，貴州白山羊MSTN 蛋白含有16 個可被激酶磷酸化的位點，其中1 個酪氨酸（Tyrosine,Y）位點、4 個蘇氨酸（Threonine,T）位點和11 個絲氨酸（Serine,S）位點，包括5 個蛋白激酶C（ProteinkinaseC,PKC）磷酸化位點，分別位于143位（FFKFSSKIQ）、144位（FKFSSKIQH）、205 位（GIWQSIDVK）絲氨酸和187 位（GTRYTGIRS）、210 位（IDVKTVLQN）蘇氨酸，其余11 個則為無特異性激酶位點。

2.3 貴州白山羊MSTN蛋白結(jié)構(gòu)域和功能模體分析

貴州白山羊MSTN 蛋白存在2 個重要功能域：轉(zhuǎn)化生長因子-β-生長分化因子8（TGF-β-GDF 8）和轉(zhuǎn)化生長因子b 前肽超家族（TGFb-propeptide super family），分別位于第268～375 和42～236 位氨基酸；該蛋白包含1 個信號肽，1 個TGFb-propeptide 結(jié)構(gòu)域，1個轉(zhuǎn)化生長因子-β家族（TGFB）和2 個低復雜度結(jié)構(gòu)域，分別位于1～18、37～267、281～375、99～110 和136～145 位氨基酸。貴州白山羊MSTN蛋白存在5 個酪蛋白激酶II 磷酸化位點（Casein kinase II phosphorylation site,CK2）：51～54（SRLE）、105～108（SLED）、123～126（TESD）、240～243（TFPE）、264～267（SRRD）；1 個亮氨酸拉鏈模塊（Leucine zipper pattern）：216～237（LKQPESNLGIEIKALDENGHDL）位氨基酸，符合Lx(6)-L-x(6)-L模塊的結(jié)構(gòu)特征；3 個N-豆蔻酰基化位點（N-myristoylation site,MYRISTYL）：37～42（GLCNAC）、183～188（GTRYTG）和201～206（GIWQSI）位氨基酸；5 個蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylation site,PKC）：50～52（SSR）、143～145（SSK）、191～193（SLK）、260～262（TPK）和264～266（SRR）位氨基酸；1 個酪氨酸激酶磷酸化位點（Tyrosine kinase phosphorylation）：178～186（KPMKDGTRY）位氨基酸；1 個EF-手型鈣結(jié)合域（EF-hand calcium-binding domain）：99～111（DDSSDGSLEDDDY）位氨基酸；1個轉(zhuǎn)化生長因子-β前體肽（TGF-beta propeptide）和1 個轉(zhuǎn)化生長因子-β樣結(jié)構(gòu)域（Transforming growth factor beta likedomain,TGF-beta）：分別位于278～375和39～257位氨基酸。

2.4 不同物種MSTN基因相似性比對及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

貴州白山羊與綿羊、牛、馬鹿、豬、家馬、人、小家鼠、褐家鼠、家犬、北極狐、赤狐、烏蘇里貉、家雞和綠頭野鴨核苷酸相似性分別為：99.47%、96.45%、96.28%、94.68%、93.71%、92.38%、89.12%、88.59%、91.22%、90.60%、90.78%、90.96%、82.54%和82.89%，氨基酸序列相似性分別為：100%、93.33%、94.93%、95.47%、94.40%、94.13%、92.02%、90.69%、93.07%、92.53%、93.07%、93.07%、87.73%和87.73%。由系統(tǒng)進化樹可知，貴州白山羊與綿羊同屬羊亞科，聚為一支，親緣關(guān)系最近，與家雞和綠頭野鴨親緣關(guān)系最遠，見圖2。

圖2 不同物種MSTN基因編碼核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of MSTN gene among different species

3 討論

基因是決定家畜重要經(jīng)濟性狀的遺傳基礎，隨著測序成本的逐漸下降及大數(shù)據(jù)組學的不斷更新，美國國家生物信息中心數(shù)據(jù)庫也注釋了大量不同物種的關(guān)鍵基因序列，為進一步研究相關(guān)基因調(diào)控經(jīng)濟性狀的功能提供了便利。本研究通過整合生物信息學與比較基因組學方法對NCBI 數(shù)據(jù)庫中貴州白山羊MSTN基因進行了較為全面的綜合分析。首先，從該基因編碼區(qū)核苷酸序列基本結(jié)構(gòu)組成、編碼蛋白質(zhì)的理化參數(shù)、二級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜區(qū)及關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域等方面做簡要預測，其次分析了該基因編碼氨基酸序列在不同物種間的同源性，并基于氨基酸序列構(gòu)建了15 個物種的系統(tǒng)進化樹，從分子水平探討了它們之間的進化關(guān)系。該結(jié)果為深入研究MSTN 基因調(diào)控不同物種骨骼肌生長發(fā)育的分子機制及改良畜禽肉質(zhì)性狀提供了比較全面的生物學基礎信息。GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄的貴州白山羊MSTN 基因全長為5 211 bp，由222 bp啟動子區(qū)、3 個外顯子和2 個內(nèi)含子（長度分別為1 834 bp和2 027 bp）組成。編碼區(qū)序列長度為1 128 bp，外顯子1 全長372 bp，翻譯第1～124 位氨基酸，外顯子2 全長375 bp，翻譯第125～249 位氨基酸，外顯子3 全長381bp，翻譯第250～375 位氨基酸。貴州白山羊基因結(jié)構(gòu)與其他哺乳動物一樣，外顯子和內(nèi)含子連接處符合RNA 剪接信號“GT…AG”法則[10]。貴州白山羊MSTN 基因編碼區(qū)A+T 含量為57.89%，高于G+C含量，這與梁春年等[11]和Stefaniuk 等[12]分別報道的牦牛和馬的研究結(jié)果基本一致。除此之外，貴州白山羊MSTN 蛋白包括1 個由18 個氨基酸組成的N-端信號肽、1 個TGFb-propeptide 結(jié)構(gòu)域，1 個轉(zhuǎn)化生長因子-β家族（TGFB）和2 個低復雜度結(jié)構(gòu)域，具有轉(zhuǎn)化生長因子家族成員典型的結(jié)構(gòu)域，這些預測的潛在特有結(jié)構(gòu)域與綿羊[13]、馬鹿[14]及福建白兔[15]MSTN 蛋白研究結(jié)果一致。信號肽位于分泌蛋白的N 端，它對分泌蛋白起著重要引導作用[16]。Martinez-ruiz 等[17]研究表明，改造信號肽可以大大提高外源蛋白的表達量，因此，可對預測的貴州白山羊MSTN 基因信號肽位置進行修飾，減少MSTN 蛋白在貴州白山羊體內(nèi)的表達，以進一步提高該品種的肌肉增長速度，提高產(chǎn)肉量。由MSTN 基因編碼氨基酸序列相似性比對結(jié)果推測，貴州白山羊與綿羊、牛和馬鹿的親緣關(guān)系最近，與嚙齒目、雞形目相對較遠，這與相似性比對分析的結(jié)果相符，也與15 個物種的形態(tài)學分類及實際演化順序一致，符合物種的進化規(guī)律，而且也反映了不同物種MSTN 編碼蛋白結(jié)構(gòu)的一致性對其生物學功能的重要意義。

在肉用動物新品種選育及培育過程中，生長、胴體及肉質(zhì)性狀作為其重要的經(jīng)濟性狀，是家養(yǎng)動物新品種選育工作的一項關(guān)鍵育種目標。體重和日增重是肉用山羊的關(guān)鍵性狀，在肉類加工業(yè)中具有重要的經(jīng)濟價值。作為一種高原山地特色肉用山羊品種資源，如能挖掘調(diào)控生長性狀關(guān)鍵基因或篩查獲得與肌肉發(fā)育連鎖的分子標記，基于分子水平探究其蛋白關(guān)鍵功能位點變異與性狀間的關(guān)系，可為后續(xù)利用基因敲除和過表達技術(shù)解析基因功能以及運用基因編輯技術(shù)開展生長性狀的遺傳改良提供分子育種策略。MSTN 基因作為肌肉生長的負調(diào)控因子，在畜禽中的研究進展表明，該基因活性的降低或喪失會造成其肌肉與其他組織的比例大大提高[18,19]。在山羊MSTN基因研究中，Bi 等[20]研究表明，MSTN 基因5'UTR 中5 bp 缺失（TTTTA）與陜北白絨山羊體高和胸寬指數(shù)顯著相關(guān)（0.01 ＜P＜0.05），可作為正調(diào)控DNA 標記用于優(yōu)良個體的選擇育種。Kolenda等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在卡緬涅茨羊和波美拉尼亞羊MSTN 基因均存在多個SNP 位點，并且某些多態(tài)性位點可以作為生長性狀的遺傳標記。Na等[22]利用PCR 產(chǎn)物直接測序方法在大足黑山羊、酉州黑山羊、波爾山羊和努比亞山羊群體的MSTN基因內(nèi)含子1、2 和3 中共檢測到20 個SNPs，其中，聯(lián)合基因型（CT-AA-TT-CC-CC）個體具有較高的初生重和斷奶重（P ＜0.05）。劉錚鑄等[23]基于PCR-RFLP 方法分析了我國主要地方山羊品種MSTN 基因內(nèi)含子2 和外顯子3 的遺傳變異。在貴州白山羊MSTN 基因應用方面，可以進一步篩選MSTN 基因突變的個體，然后通過分子標記輔助選擇技術(shù)培育出產(chǎn)肉率高的優(yōu)良個體。