陳小金，張俊哲，曲 鵬，侯文婷，殷其剛，趙 丹，霍 蕾，肖 妍，張海濱

（1.天津海關(guān)工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津 300461；2.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300461；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea，BVD）又稱(chēng)牛病毒性腹瀉-黏膜病，臨床上以發(fā)熱、腹瀉、黏膜病變以及懷孕母牛繁殖障礙為主要特征[1]，其病原為牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）。除造成以上臨床癥狀外，該病還能導(dǎo)致患畜免疫力降低，繼而引起其他病原的繼發(fā)感染，使病畜死亡率明顯增加，給全世界養(yǎng)牛業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

根據(jù)5'UTR和自體蛋白酶的差異，BVDV可分為兩種基因型——I型（BVDV-1）和II型（BVDV-2），目前我國(guó)流行的主要是BVDV-1[4]。在BVDV粒子表面的3種囊膜蛋白（Erns、E1和E2）中，E2蛋白是含量最豐富的表面蛋白，且包含BVDV主要的中和抗原位點(diǎn)，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體能預(yù)防BVDV感染[5]。E2蛋白通過(guò)二硫鍵形成的E2-E2同源二聚體和E2-E1異二聚體，鑲嵌在病毒粒子表面[6]。E2蛋白在BVDV入侵過(guò)程中，幫助病毒附著在宿主細(xì)胞上，促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞完成復(fù)制和增殖，且決定了病毒的種屬嗜性[7]。鑒于E2蛋白功能多樣性及重要性，E2蛋白一直是研究BVDV的主要熱點(diǎn)蛋白，有關(guān)其表達(dá)及免疫原性的研究屢見(jiàn)報(bào)道[8]。

BVDV是黃病毒科瘟病毒屬成員，同屬成員包括豬瘟病毒（CSFV）、羊邊界病病毒（BDV）等[9]。E2蛋白是瘟病毒最主要的抗原蛋白，在不同種間含有部分共同抗原表位及特異性抗原表位，由此帶來(lái)了血清學(xué)交叉反應(yīng)。BVDV與CSFV均能感染豬，因此豬群中這2種病原的抗體檢測(cè)可相互干擾，給疾病診斷和防控帶來(lái)挑戰(zhàn)[10]。

本研究選取BVDV E2蛋白的5個(gè)保守抗原表位，以柔性氨基酸（GSGS）將5個(gè)表位（E1～5）串聯(lián)（串聯(lián)的多肽鏈被命名為5BE），利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白His-5BE，純化后免疫小鼠制備多克隆抗體并鑒定抗體的反應(yīng)性，以期為制備單克隆抗體及建立BVDV檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

質(zhì)粒pET-28a（+），由宜春學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞TOP10和BL21（DE3），購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

2×RapidTaqMaster Mix和DL 2 000 plus DNA Maker，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、通用型ECL發(fā)光底物、BCA蛋白定量試劑盒、預(yù)染蛋白Maker，均購(gòu)自上海圣爾生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和XhoI，購(gòu)自NEB（北京）有限公司；T4 DNA連接酶，購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；PCR凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白），購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限公司。

1.3 基因合成及引物合成

按照?qǐng)D1所示基因序列，合成編碼5BE多肽鏈基因。5BE編碼基因由通用生物（安徽）股份有限公司合成，以pUC-5BE質(zhì)粒形式提供。為將5BE編碼基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（+），設(shè)計(jì)一對(duì)攜帶酶切位點(diǎn)的引物5BE-F和5BE-R，通過(guò)BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)連入pET-28a（+）載體。同時(shí)，設(shè)計(jì)一對(duì)載體引物pET-28a-F和pET-28a-R，用于鑒定在pET-28a（+）載體多克隆位點(diǎn)區(qū)插入的目的基因（表1）。

表1 設(shè)計(jì)的引物序列

圖1 BVDV E2蛋白抗原表位的串聯(lián)

1.4 重組載體構(gòu)建與鑒定

以質(zhì)粒pUC-5BE為模板，利用引物5BE-F和5BE-R擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的5BE片段。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：2×RapidTaqMaster Mix 25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、質(zhì)粒模板1 μL、ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

圖2 PCR擴(kuò)增5BE基因結(jié)果

采用PCR凝膠回收試劑盒，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。使用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和XhoI，對(duì)質(zhì)粒pET-28a（+）和純化的5BE片段進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物不經(jīng)凝膠分離，直接過(guò)柱回收。將雙酶切后回收的5BE與載體pET-28a（+）連接。連接體系（10 μL）：5BE 2 μL、載體6 μL、連接酶緩沖液1 μL、T4連接酶 1 μL。16 ℃連接4 h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化完成后涂布于含卡那抗性的LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。

挑取若干單菌落進(jìn)行搖菌，待菌液搖混，取菌液1 μL作為模板，利用載體引物pET-28a-F和pET-28a-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定陽(yáng)性菌液。將經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液，送公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序鑒定正確無(wú)誤的菌液以1:100比例接種至10 mL卡那抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)。在菌液OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG使其濃度達(dá)到0.5 mmol/L，繼續(xù)于37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。離心收集誘導(dǎo)后的菌體沉淀，加入1 mL PBS重懸菌體，置于冰上進(jìn)行超聲波破碎。超聲條件設(shè)為功率20%、超聲2 s、停歇2 s、超聲時(shí)長(zhǎng)10 min。超聲后，10 000 r/min，4 ℃離心10 min，分成上清和沉淀。將沉淀用1 mL PBS重懸，分別取超聲后的全菌樣品、離心后上清樣品以及離心后重懸的沉淀樣品各40 μL，加入10 μL 5×Loading Buffer，煮沸5 min，制備蛋白樣品。最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色，分析蛋白的表達(dá)情況。

1.6 蛋白純化與鑒定

根據(jù)目的蛋白表達(dá)形式，采用康為世紀(jì)生物有限公司的可溶性His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組蛋白His-5BE，通過(guò)SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白純度，利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化的蛋白濃度。

1.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與免疫

選取6周齡左右的BALB/c雌性小鼠3只，免疫前尾靜脈采血，將采集血清作為陰性血清對(duì)照。將純化的重組蛋白稀釋至1 μg/μL，與等體積弗氏佐劑充分混合乳化，在小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射，按200 μL/只免疫（抗原100 μg/只）。每次免疫間隔3周，共免疫3次，第3次免疫后14 d尾靜脈采血分離血清。

1.8 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA測(cè)定多克隆抗體效價(jià)。用碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白His-5BE稀釋至1 μg/mL，每孔100 μL包被ELISA板，4 ℃包被過(guò)夜；包被后，PBST洗滌3次，將100 μL含5%脫脂乳的PBS加入孔中，于37 ℃封閉2 h；封閉后，PBST洗滌3次，加入倍比稀釋的血清（1:1 000～1:640 000），37 ℃反應(yīng)1 h；PBST洗滌3次，然后加入1:5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，每孔加入100 μL TMB底物溶液，避光反應(yīng)5 min，加入終止液（2 mol/L H2SO4）100 μL/孔；最后在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450，計(jì)算抗體效價(jià)。

1.9 多克隆抗體反應(yīng)性鑒定

重組蛋白His-5BE經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%脫脂乳37 ℃封閉2 h；PBST洗滌3次，10 min/次（下同），將1:500稀釋的5BE多抗血清作為一抗，于室溫孵育NC膜2 h；PBST洗滌3次，以1:5 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG作為二抗，于室溫反應(yīng)1 h；PBST洗滌3次，然后加入ECL發(fā)光液，置于曝膜儀顯影拍照。

2 結(jié)果

2.1 5BE基因合成與重組載體構(gòu)建

參照沈小芳[11]的研究結(jié)果，在BVDV NADL株E2蛋白上，選擇與CSFV E2蛋白高度保守的5個(gè)抗原表位相對(duì)應(yīng)的5個(gè)表位序列，分別命名為BVDV E1～5（表2）。將5個(gè)表位以氨基酸GSGS柔性串聯(lián)（E1-E1-GSGS-E2-E2-GSGS-E3-E3-GSGS-E4-E4-GSGS-E5-E5，縮寫(xiě)為5BE，圖1-A），5BE對(duì)應(yīng)的基因序列如圖1-B所示。5BE序列由公司合成，克隆到pUC載體上。

表2 BVDV NADL株E2蛋白的5個(gè)抗原表位

以pUC-5BE質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出帶有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的5BE基因（圖2）。通過(guò)傳統(tǒng)的酶切連接方式，把5BE基因與原核表達(dá)載體pET-28a（+）連接；利用載體引物pET-28a-F和pET-28a-R，對(duì)連接轉(zhuǎn)化所得的菌落進(jìn)行PCR鑒定，將菌液鑒定陽(yáng)性的克隆送公司進(jìn)行序列測(cè)定。

測(cè)序結(jié)果（圖3）表明，5BE被成功連入到pET-28a（+）載體的BamHI和XhoI位點(diǎn)之間，沒(méi)有發(fā)生移碼，且該克隆中的5BE基因與5BE原始基因?qū)Ρ?，沒(méi)有發(fā)生突變，重組載體pET-28a-5BE構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒pET-28a-5BE測(cè)序鑒定結(jié)果

2.2 重組蛋白His-5BE表達(dá)與純化

選取測(cè)序確證無(wú)誤的克隆，從中提取質(zhì)粒pET-28a-5BE，然后轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將處理菌液分成全菌、上清、沉淀3種樣品，進(jìn)行SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色。從圖4可以看出，與空載體pET-28a誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物相比，重組蛋白His-5BE獲得表達(dá)，位于17～25 kD，與預(yù)期大?。?2 kD）相符。His-5BE表達(dá)量較大，主要以包涵體形式存在，但在上清中也有部分表達(dá)。

圖4 重組蛋白His-5BE的表達(dá)分析結(jié)果

由于部分重組蛋白His-5BE是可溶性表達(dá)，因此采用Ni柱親和層析方式純化帶有His標(biāo)簽的目的蛋白。純化后，通過(guò)蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白純化效果。結(jié)果（圖5）顯示，純化的His-5BE純度較高，雜帶較少，且目測(cè)蛋白濃度也較高。通過(guò)BCA法測(cè)得純化蛋白的質(zhì)量濃度達(dá)到1.54 mg/mL，能夠滿(mǎn)足免疫要求。

圖5 純化蛋白His-5BE考馬斯亮藍(lán)染色分析結(jié)果

2.3 5BE蛋白多克隆抗體ELISA效價(jià)測(cè)定

用建立的間接ELISA方法，對(duì)梯度稀釋的多抗血清及陰性血清對(duì)照進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。結(jié)果（圖6）顯示：多抗血清1:1 000稀釋時(shí)的OD450為3.68，而此稀釋度下陰性血清的OD450僅為0.26；當(dāng)多抗血清稀釋至32萬(wàn)倍及以上時(shí)，多抗血清的OD逐漸接近陰性血清的OD，說(shuō)明制備的His-5BE的多抗血清效價(jià)至少達(dá)到1:160 000。

圖6 His-5BE蛋白多克隆抗體ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果

2.4 5BE蛋白多抗血清Western Blot檢測(cè)

為驗(yàn)證多抗血清的反應(yīng)性及純化蛋白純度，以純化的重組蛋白His-5BE為樣品，以5BE蛋白多抗為一抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果（圖7）顯示，在His-5BE預(yù)期位置，出現(xiàn)明顯的特異性條帶，說(shuō)明制備的抗血清1:500稀釋時(shí)具有良好的反應(yīng)性。

圖7 His-5BE蛋白多抗血清的Western Blot檢測(cè)結(jié)果

3 討論

BVDV宿主范圍較廣，包括牛、豬、羊、駱駝等動(dòng)物[12]。牛群中BVDV血清抗體陽(yáng)性率普遍很高，而且各地區(qū)流行的BVDV亞型各有不同，我國(guó)流行的以BVDV-1為主[10]。近年來(lái)，我國(guó)豬群中BVDV感染率逐漸升高。豬感染BVDV無(wú)明顯臨床癥狀或出現(xiàn)類(lèi)似輕癥豬瘟臨床表現(xiàn)，但BVDV可引發(fā)仔豬持續(xù)性感染和免疫抑制，導(dǎo)致豬體免疫力下降，易誘發(fā)其他病原感染[13]。徐磊等[14]對(duì)福建省豬源BVDV流行與分布情況進(jìn)行了批量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BVDV抗體陽(yáng)性率為35.6%（5 891/16 537），400份樣品中BVDV病原陽(yáng)性率為15.3%，表明福建省豬源BVDV感染較普遍，且BVDV感染對(duì)CSFV抗體產(chǎn)生有抑制作用。近幾年，我國(guó)多家研究單位從血清制品和生物制品中檢測(cè)到BVDV污染，而諸如胎牛血清污染BVDV和細(xì)胞污染BVDV將給疫苗生產(chǎn)，特別是CSFV疫苗帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)[15-17]。因此，在對(duì)豬進(jìn)行CSFV檢測(cè)的同時(shí)有必要進(jìn)行BVDV檢測(cè)。

E2蛋白是瘟病毒最主要的抗原蛋白，承載著B(niǎo)VDV與CSFV的主要抗原位點(diǎn)，同時(shí)E2蛋白保守性較低，其編碼基因含有較多的變異位點(diǎn)，可作為BVDV分型的依據(jù)[2]。由于BVDV與CSFV有血清學(xué)交叉反應(yīng)，常規(guī)血清學(xué)方法很難準(zhǔn)確檢測(cè)BVDV。為解決這一問(wèn)題，擬制備E2蛋白的單克隆抗體，以E2蛋白特異性單抗來(lái)檢測(cè)BVDV。為此，從BVDV E2蛋白上找到與CSFV E2上抗原表位差異較大的表位，將這些表位串聯(lián)重復(fù)依次連接，采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化重組蛋白His-5BE，以純化的His-5BE蛋白作為免疫原，免疫小鼠制備多抗血清，并為單克隆抗體制備做準(zhǔn)備。

本研究誘導(dǎo)表達(dá)的His-5BE主要存在于包涵體中，也有少量是可溶性表達(dá)。對(duì)上清中的His-5BE進(jìn)行親和層析純化，將純化的目的蛋白免疫小鼠制備了抗5BE多克隆抗體。以His-5BE為包被原，采用間接ELISA測(cè)得多抗血清的效價(jià)高達(dá)16萬(wàn)倍，且Western Blot試驗(yàn)也證實(shí)將該多抗稀釋500倍，能與目的蛋白發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，說(shuō)明免疫His-5BE激發(fā)了BALB/c小鼠強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。該研究為建立BVDV檢測(cè)方法及后續(xù)制備單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。