宋芳芳，劉春菊，任煒杰，遲田英，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種烈性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織公布的法定報告動物疫病之一，是我國的一類動物疫病。世界動物衛(wèi)生組織ASF形勢報告顯示，2020年前ASF就已在全球32個國家流行，感染超100萬頭家豬和超2.8萬頭野豬，給全球生豬產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重影響[1-3]。

ASFV為雙鏈DNA病毒，作為非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）家族的唯一成員，有超過150個編碼區(qū)，大小從170 kb到190 kb不等[4]。病毒粒子直徑約為250 nm，由中心類核、內(nèi)脂蛋白膜、二十面體蛋白外衣殼和外脂蛋白包膜組成[5]。ASFV在細(xì)胞內(nèi)外均具有傳染性，且在環(huán)境中具有很強的生存能力[6]。作為目前全球生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的威脅之一[1-2]，ASF至今仍無有效治療手段，也沒有可提供廣泛交叉免疫反應(yīng)的疫苗，因此開發(fā)一種有效的ASFV疫苗迫在眉睫。

ASFV疫苗可分為減毒活疫苗、滅活疫苗、病毒載體疫苗、哺乳動物表達(dá)質(zhì)?；驇追N疫苗的組合。病毒載體疫苗是指將致病微生物的免疫保護(hù)性基因插入到載體病毒的非必須區(qū)構(gòu)建重組病毒，經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗[3]。病毒載體疫苗能穩(wěn)定誘導(dǎo)抗原特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可作為ASF防控技術(shù)研發(fā)的重點方向。本文綜述了基于不同病毒載體的ASFV疫苗研究進(jìn)展，以期為推進(jìn)ASF病毒載體疫苗研究及進(jìn)一步研發(fā)具有高度保護(hù)潛力的ASFV疫苗提供參考。

1 病毒載體疫苗概述

病毒載體疫苗（Viral vector vaccines）是由Jackson等[7]提出的一種利用基因編輯后沒有毒性的病毒作為載體，遞送免疫原的新型疫苗開發(fā)技術(shù)。優(yōu)化后的病毒載體可提高基因組的包裝能力和復(fù)制能力，同時增強病毒的細(xì)胞趨向性，可用于定制特定的免疫反應(yīng)[8]?，F(xiàn)已有多種病毒被應(yīng)用于相關(guān)病毒載體疫苗的開發(fā)，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒、甲病毒、沙粒病毒、皰疹病毒和橫紋肌病毒等[9]，各病毒載體均有其自身優(yōu)缺點，載體病毒不同，其疫苗的具體性質(zhì)也不同。

病毒載體疫苗綜合了DNA疫苗和減毒活疫苗的優(yōu)點，既可像DNA疫苗一樣攜帶DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)抗原蛋白，引發(fā)系列免疫反應(yīng)，又可像減毒活疫苗一樣在體內(nèi)復(fù)制[10]。此外，病毒載體疫苗安全性較高，研發(fā)時可通過使用免疫原基因去除或替換病毒載體中的毒力基因，或者通過破壞病毒載體的復(fù)制能力確保安全性。此外病毒載體編碼的免疫原還可作為標(biāo)記物，用于區(qū)分感染動物與疫苗接種動物。病毒載體同樣具有缺點，如生產(chǎn)過程復(fù)雜[11]，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對載體病毒本身的中和抗體[12]及無法使用相同技術(shù)重復(fù)接種[13]，針對上述問題，現(xiàn)已通過采用相關(guān)策略進(jìn)行克服，如將抗原納入衣殼而產(chǎn)生嵌合載體[14]，或構(gòu)建共價修飾型和輔助病毒依賴型載體等[15]。因此，病毒載體疫苗仍是一種有著較大發(fā)展?jié)摿η铱蓮V泛適用的疫苗開發(fā)平臺。

2 不同病毒載體疫苗發(fā)展現(xiàn)狀

2.1 桿狀病毒載體

桿狀病毒（BacMam）是桿狀病毒科的雙鏈包膜DNA病毒，是目前研究最多的昆蟲病毒之一，也是最早被用作傳遞靶向基因制造ASF診斷藥物和疫苗的載體[16]。BacMam系統(tǒng)具有包裝容量大且易于生產(chǎn)的優(yōu)勢。

Carrascosa等[17]利用BacMam載體表達(dá)p12蛋白免疫家豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化重組p12免疫的豬并未對ASF產(chǎn)生保護(hù)性免疫作用。Ruiz-Gonzalvo等[18]則構(gòu)建了攜帶ASFV血凝素（HA）基因的重組BacMam疫苗，發(fā)現(xiàn)疫苗接種后可刺激機(jī)體產(chǎn)生與ASFV感染恢復(fù)期動物體內(nèi)相似的保護(hù)性抗體。Gómez-Puertas等[19]利用BacMam載體表達(dá)p54和p30蛋白發(fā)現(xiàn)：接種p54或p30 BacMam疫苗的豬并未受到保護(hù)，其疾病進(jìn)程也無顯著變化；但接種了p54/p30融合蛋白BacMam載體疫苗免疫的豬，其疾病進(jìn)程則發(fā)生了顯著改變。這可能是因為上述疫苗同時刺激了病毒中和的兩種機(jī)制。Argilaguet等[20]用BacMam-sHAPQ，即一種編碼p30、p54和分泌性血凝素（sHA）的BacMam結(jié)構(gòu)，對豬先免疫再攻毒，發(fā)現(xiàn)2/3的免疫豬體內(nèi)無病毒，這也證明了T細(xì)胞在預(yù)防ASF方面的關(guān)鍵作用。

BacMam載體在ASFV載體疫苗研究中較為常用，可能與其可獲得良好的黏膜免疫效果相關(guān)[21]。Heimerman等[22]還證明了BacMam載體在制備針對p72重組抗原片段單克隆抗體方面的有效性。

2.2 牛痘病毒載體

改良后的安卡拉牛痘病毒（MVA）可編碼一種或多種外源抗原，并可引發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，具有固有的佐劑特性。大量臨床試驗已證實了MVA載體疫苗的安全性和有效性[23]。

Lopera-Madrid等[24]通過MVA載體系統(tǒng)，遞送表達(dá)ASFV的免疫保護(hù)性相關(guān)抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的相關(guān)亞單位疫苗均可誘導(dǎo)接種豬的T細(xì)胞反應(yīng)并刺激相關(guān)抗體的產(chǎn)生。此外，Lopera-Madrid[25]還指出如何通過選擇啟動子獲得相關(guān)免疫原性抗原的高表達(dá)，這可能是未來開發(fā)以MVA為遞送載體的ASFV亞單位疫苗的研究方向。

由于MVA載體疫苗可使免疫豬穩(wěn)定獲得對ASFV各抗原蛋白的T細(xì)胞、B細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此利用MVA載體遞呈ASFV抗原復(fù)合物，以加強免疫效果，提供穩(wěn)定的保護(hù)性免疫能力，使免疫豬可以對抗同源和異源ASFV感染，將是未來開發(fā)ASFV疫苗的候選策略之一[26]。

2.3 甲病毒載體

甲病毒屬于Togaviridae家族的RNA正義單鏈病毒，可在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，作為疫苗載體可消除病毒基因整合到宿主基因組中的可能。甲病毒載體疫苗目前已被用作開發(fā)針對各種病毒、細(xì)菌、原生動物和腫瘤抗原疫苗的平臺[27]。被用于疫苗構(gòu)建的甲病毒載體包括委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）、辛德比斯病毒（SINV）、塞姆利基森林病毒（SFV）以及VEEV-SINV。

現(xiàn)已證實基于甲病毒載體的疫苗對豬的幾種病毒性疫病（包括ASF）安全有效[25]。Murgia等[28]利用甲病毒載體將ASFV抗原復(fù)制子顆粒（RP）傳遞給豬并檢測豬Vero細(xì)胞中ASF抗原p30（RP-30）、p54（RP-54）和pHA-72（RP-sHA-p72）的表達(dá)和免疫原性。結(jié)果顯示，p30表達(dá)量最高且免疫原性最強，隨后分別是p54和pHA-72，體現(xiàn)出體外蛋白表達(dá)與體內(nèi)免疫原性間的相關(guān)性。后續(xù)可通過預(yù)測RP結(jié)構(gòu)并分析其免疫原性，構(gòu)建甲病毒載體疫苗，以增強對ASFV表位的識別。

2.4 腺病毒載體

腺病毒是一種具有遺傳多樣性的DNA病毒，可在多種動物以及人類中引起眼、呼吸道或胃腸道上皮的非致命性感染。作為可將基因或抗原遞送到目標(biāo)宿主組織的優(yōu)良載體，腺病毒載體同樣是最常用的重組疫苗候選載體之一。

Lokhandwala等[29-30]評估了兩種ASFV多抗原混合物活載體疫苗的免疫原性和安全性，其中表達(dá)結(jié)構(gòu)抗原（p32、p54、pp62和p72）的腺病毒混合物免疫豬后可誘導(dǎo)IgG、IFN-γ + T細(xì)胞和CTL響應(yīng)，利用腺病毒載體遞呈新型ASFV抗原混合物A151R、B119L、B602L、EP402R1PRR、B438L、K205R和A104R，免疫豬后也得到了相同結(jié)果。Goatley等[31]發(fā)現(xiàn)ASFV基因B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L和MGF5055R，在使用人腺病毒5（rAd）和Ankara重組修飾疫苗遞呈并接種豬后，可以保護(hù)豬抵御致死劑量ASFV的感染。Liu等[32]對小鼠和豬進(jìn)行肌肉和鼻腔接種攜帶不同抗原的ASFV腺病毒載體疫苗混合物，均取得了較好的免疫效果，且可為養(yǎng)殖豬提供高效的免疫保護(hù)，同時未觀察到抗原間的顯著干擾，這進(jìn)一步證實了ASFV腺病毒載體疫苗的安全性和有效性。

相較于減毒疫苗，相關(guān)ASFV腺病毒載體疫苗雖可誘導(dǎo)有效的抗原特異性免疫反應(yīng)，但其在ASFV強毒感染后顯示出的保護(hù)效果可能依舊有限[33]。未來ASFV新的潛在保護(hù)性抗原的挖掘?qū)谙俨《据d體ASFV疫苗的開發(fā)和保護(hù)性免疫效果的增強至關(guān)重要。

2.5 慢病毒載體

慢病毒（LV）表達(dá)載體能在細(xì)胞中穩(wěn)定持久的表達(dá)被轉(zhuǎn)染基因，且表達(dá)的相關(guān)蛋白能誘導(dǎo)出抗原特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，是常用的病毒載體[34-35]，也是穩(wěn)定轉(zhuǎn)移基因到真核細(xì)胞的可靠工具[36]。與來源于腫瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體不同，LV表達(dá)載體可為原代細(xì)胞提供穩(wěn)定的基因遞送，且表現(xiàn)出低免疫原性。此外，在LV系統(tǒng)表達(dá)的蛋白泛素偶聯(lián)酶（UBCv1），是目前已知的唯一由病毒編碼的偶聯(lián)酶，可調(diào)節(jié)宿主先天免疫和炎癥信號的傳遞，并在機(jī)體抗病毒反應(yīng)的形成中起重要作用[37]。

在ASF基因工程中使用LV的報道較為有限。De Oliveira等[38]在研究中首次發(fā)現(xiàn)了ASFVI329L基因在LV系統(tǒng)中表達(dá)的可能性，該基因可以用于編碼細(xì)胞膜及其表面的糖基化蛋白，抑制dsRNA刺激的NFκB和IRF3激活，從而調(diào)節(jié)宿主先天免疫，表明研發(fā)I329L基因缺失苗是研發(fā)ASFV疫苗的候選策略。Zhang等[39]成功在LV系統(tǒng)中表達(dá)ASFV DP71L蛋白，證明了DP71L在靜息細(xì)胞中可以引起真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的去磷酸化，并可增強共轉(zhuǎn)染報告基因的表達(dá)。Masujin等[40]利用LV系統(tǒng)將SV40大T抗原（SV40LT）和豬端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（pTERT）基因?qū)朐i腎巨噬細(xì)胞，最終獲得了一種具有中晚期巨噬細(xì)胞表型特征的永生化細(xì)胞系。該細(xì)胞系具有抗ASFV感染的能力，并適用于多種ASFV體外檢測。

3 結(jié)語

目前已證實，桿狀病毒、腺病毒、甲病毒和牛痘病毒載體均可誘導(dǎo)有效的ASFV抗原特異性反應(yīng)，但在ASFV感染特別是強毒感染后，基于現(xiàn)有免疫原的病毒載體疫苗顯示出的保護(hù)作用仍較為有限。未來可通過繼續(xù)發(fā)掘ASFV新型免疫原，并結(jié)合對相關(guān)病毒載體的優(yōu)化改造，研發(fā)出防治效果更加優(yōu)異的ASFV疫苗，爭取早日全面戰(zhàn)勝ASF疫情。