趙宗偉，馬啟祿，王鶴童，李翠萍

1.濮陽縣子岸鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心，河南濮陽 457100；2.安陽市殷都區(qū)畜牧服務中心，河南安陽 455000；3.平輿縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，河南平輿 463400；4.商丘市動物檢疫和疫病預防控制中心，河南商丘 476000）

水禽細小病毒病是一種急性、高傳染性疾病，可引起雛鵝和番鴨較高的發(fā)病率和病死率，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。根據(jù)遺傳特征、中和試驗結果和宿主范圍可將水禽細小病毒分為鵝細小病毒（goose parvovirus，GPV）相關類群和番鴨細小病毒（muscovy duck parvovirus，MDPV）相關類群[1-2]。近年來，一種新型鵝細小病毒（novel goose parvovirus，NGPV）被報道，已有的研究證明該病毒為GPV的衍生株[3]。MDPV僅感染番鴨，可導致3周齡以下番鴨出現(xiàn)心包積液、肝臟病變、胰腺壞死等組織病理學變化[4-5]，臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，足虛弱、氣喘、腹瀉和死亡[6-7]。MDPV在器官中可以多階段復制[7-10]。盡管疫苗接種能夠降低MDPV感染風險，但這種急性傳染病仍然對水禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展構成了嚴重威脅。本文從MDPV感染的病原學、流行病學、診斷技術和綜合防控等方面進行了闡述，以期為從業(yè)者學習和了解該病毒提供較為系統(tǒng)的內(nèi)容，也為番鴨細小病毒病防控提供參考資料。

1 病原學

MDPV屬于細小病毒亞科依賴病毒屬，是一種無囊膜、單鏈DNA病毒，病毒粒子為球形，呈正二十面體對稱結構，直徑為20～25 nm。MDPV基因組全長約5.1 kb，包括2個開放閱讀框（open reading frame，ORF）。左側ORF編碼的2個非結構蛋白（NS1和NS2）主要參與病毒復制和調(diào)節(jié)，又稱為調(diào)節(jié)蛋白（regulatory protein，REP）；右側ORF編碼的3個衣殼蛋白（VP1、VP2和VP3）是細小病毒嗜性、致病性和宿主范圍的重要決定因素[11]。VP1、VP2和VP3在3'端具有相同的基因序列和終止密碼子，但其起始密碼子位于序列的不同位置。VP3是MDPV主要的衣殼蛋白和保護性抗原，其含有的抗原表位能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，并對其他水禽細小病毒提供保護性的交叉免疫。此外，在MDPV基因組的兩端還存在著約456 bp的倒置末端重復序列（inverted terminal repeat，ITR）、1個末端解析位點（terminal resolution site，TRS）、Rep蛋白結合位點（rep binding elements，RBSs）和其他轉(zhuǎn)錄因子結合位點等，均與基因復制和轉(zhuǎn)錄等密切相關。ITR外部可以自行折疊形成回文發(fā)卡結構，而其內(nèi)部則與3'ITR的序列反向互補，使整個病毒基因組形成更大范圍的回文結構[12-13]。

重組和變異在細小病毒快速進化中起著重要作用。研究者在我國多個省份的鴨群中分離到一種新的重組MDPV（rMDPV），該病毒感染的小鴨腸道發(fā)生栓塞，死亡率高。分析結果顯示，該病毒由經(jīng)典MDPV與經(jīng)典GPVs交換了部分VP3基因序列后重組而來[14-15]。與GPV相比，rMDPV ITRs與經(jīng)典MDPV具有更高的同源性，其Rep蛋白也與經(jīng)典MDPV同源性很高。rMDPV ITRs和Rep蛋白之間的相互作用不受重組影響[16]。

2 流行病學

番鴨細小病毒病最早由我國發(fā)現(xiàn)，隨后法國和日本等國家也陸續(xù)報道該病[6，17-19]。我國臺灣地區(qū)發(fā)生了2起水禽細小病毒感染事件[20]。第1次疫情與GPV相關，影響了鵝和番鴨；第2次疫情與MDPV相關，該次疫情中許多品種的鴨受影響，但鵝幸免于難。1997—1998年，美國加利福尼亞州商品番鴨出現(xiàn)身體虛弱，無法行走且死亡率高的情況，剖檢發(fā)現(xiàn)患病鴨腿部肌肉和心肌蒼白，肝臟有纖維蛋白滲出物，經(jīng)鑒定證實病原為MDPV[6]。2011年我國在廣西商品番鴨中檢測到MDPV，患病鴨主要臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉和運動功能障礙[21]。MDPV只感染番鴨，在雞、鵝、麻鴨、半番鴨和櫻桃谷鴨等中暫無臨床發(fā)病的報道，且人工感染不發(fā)病[15，22]。MDPV對鵝沒有致病性，而GPV不僅對雛鵝具有致病性，而且對番小鴨也具有致病性[7，19]。番鴨細小病毒病的流行無明顯季節(jié)性，但由于冬春季節(jié)氣溫較低，育雛室因控溫導致空氣流通不夠，空氣質(zhì)量較差，從而導致該病的發(fā)病率和病死率相對更高。MDPV主要通過呼吸道和消化道傳播，如可通過患病鴨的排泄物再經(jīng)飼料、飲水及飼養(yǎng)設施進行傳播[23]，還可污染種蛋及孵化室，造成雛鴨批量發(fā)病。

MDPV感染的潛伏期通常為4～9 d，病程為2～7 d。根據(jù)感染雛鴨的日齡不同，MDPV感染的死亡率也存在一定差異，死亡率最高可達80%。雖然3周齡后鴨子感染的死亡率要低得多，但感染治愈后會出現(xiàn)骨骼肌退化和生長遲緩的癥狀，且生產(chǎn)性能降低，不再具備經(jīng)濟價值。發(fā)病鴨通常表現(xiàn)為運動功能障礙、生長發(fā)育遲緩、水樣腹瀉和死亡。剖檢可見患病鴨心臟呈圓形，心臟壁松弛，肝臟腫脹脆弱，胰腺內(nèi)有白色壞死斑點，腸黏膜有炎癥、出血，腸內(nèi)容物中有脫落的腸黏膜，部分還可見身體骨骼肌質(zhì)量減少和腿部骨骼肌蒼白[24-25]。

3 診斷技術

3.1 病毒分離培養(yǎng)

病毒分離培養(yǎng)是一種常用的診斷技術，在病毒性疾病防控中起著重要作用。將MDPV感染病料經(jīng)尿囊腔接種10日齡番鴨胚，培養(yǎng)5 d，盲傳5代，可發(fā)現(xiàn)試驗組番鴨胚死亡且較對照組鴨胚小，絨毛尿囊膜增厚，胚胎充血并出現(xiàn)溶血現(xiàn)象[23]。MDPV還可以在番鴨胚腎（MDEK）和番鴨胚成纖維細胞（MDEF）中增殖。Poonia等[26]將病料組織勻漿液接種番鴨胚后的尿囊液在MDEF中連續(xù)傳代6次后，發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)病變，隨后利用透射電子顯微鏡和PCR方法證明MDPV被成功分離。黃瑜[27]將番鴨胚傳代的MDPV接種到原代鴨胚成纖維細胞（DEF）中，發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)變差，出現(xiàn)明顯的細胞病變（變細、變長），利用免疫熒光試驗（IFA）可檢測到免疫熒光信號。目前SPF級別的番鴨胚獲取難度較大，病毒分離容易受母源抗體干擾。然而MDPV接種細胞后需要適應細胞環(huán)境，傳代次數(shù)較多，因此番鴨胚依然是進行MDPV分離的首要選擇。

3.2 血清學診斷

血清學診斷主要是利用抗原、抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結合反應來實現(xiàn)檢測目的的方法。目前，針對MDPV常用的血清學診斷方法有免疫熒光IFA、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）以及瓊脂擴散試驗（AGP）等。

3.2.1 IFA IFA最早于1942年被首次報道，并在1950年被完善，借助熒光顯微鏡，可以觀察到組織或者細胞的特異性免疫反應，實現(xiàn)對特定抗原的定位和定性分析[28]。IFA特異性強、敏感性高，已被廣泛應用于科學研究和臨床診斷。Le Gall-Reculé等[29]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)克隆了MDPV衣殼蛋白VP2和VP3的編碼基因，使其在昆蟲細胞中表達，并通過IFA技術在昆蟲細胞的細胞核中發(fā)現(xiàn)了重組蛋白。Yin等[30]借助IFA技術測定并評估了單克隆抗體對GPV和MDPV VP3蛋白天然結構的識別情況，不僅發(fā)現(xiàn)單克隆抗體與VP3蛋白發(fā)生了結合，還確認該蛋白主要存在于細胞核中，很少在感染細胞的細胞質(zhì)中。Woolcock等[6]從1～4周齡商品番鴨中分離到MDPV，并利用IFA對其抗體進行了檢測。

3.2.2 ELISA ELISA方法是最早由瑞典科學家Engvall和Perlmann[31]以及荷蘭科學家Schuurs和Van Weemen[32]構思出來的一種免疫酶技術，它取代了原有的放射免疫檢測，降低了放射免疫檢測中放射性標記抗原或抗體帶來的危害。目前ELISA方法已經(jīng)在MDPV抗體檢測中得到較為廣泛的應用。

3.2.3 AGP AGP方法中，可溶性抗原與相應抗體（抗血清）在瓊脂凝膠中向四周擴散，如果抗原和抗體相對應，則會在適當比例處形成肉眼可見的白色沉淀線，從而用于抗原或抗體的定性檢測[33]。何海蓉等[34]將MDPV M91毒株接種鵝胚，收獲鵝胚尿囊液濃縮后制備了AGP抗原，與抗MDPV免疫血清組合建立了AGP方法。該方法可用于MDPV疫苗的免疫檢測，但它與GPV存在交叉反應，特異性效果不理想。

3.3 分子生物學診斷

3.3.1 聚合酶鏈式反應（PCR） PCR是一種功能強大的擴增技術，可以從少量起始材料（即DNA模板或目標序列）中生成充足的特定DNA片段，已成為病毒檢測和分型不可缺少的工具。Wan等[35]建立了可以實現(xiàn)MDPV和GPV鑒別診斷的雙重PCR方法，最低檢測限可達103copies/μL。饒體宇等[36]建立了針對鴨瘟病毒、GPV和MDPV的三重PCR檢測方法，可以實現(xiàn)對3種病原的鑒別診斷，最低檢測限分別為237.30、22.45和204.60 pg。

3.3.2 實時熒光定量PCR（qPCR） qPCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎上引入熒光探針，在提高檢測特異性和靈敏度的同時，實現(xiàn)了檢測結果的實時監(jiān)測，已被廣泛用于病毒發(fā)病機制研究和流行病學監(jiān)測。謝麗基等[37]參考GenBank中MDPVREP基因序列，設計了特異性引物及探針，建立了檢測MDPV的qPCR方法，擴增時間僅需30 min，敏感性可達20 copies/μL，較常規(guī)PCR敏感100倍。在此基礎上，謝麗基等[38]又建立了可以同時檢測鴨I型肝炎病毒和MDPV的雙重qPCR方法。吳雙等[39]建立了鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨腸炎病毒（DEV）和MDPV的TaqMan三重qPCR診斷方法，可以檢測到101copies/μL的MDPV陽性標準質(zhì)粒。林甦等[40]基于SYBR Green I方法，建立了一種可以同時檢測GPV和MDPV的qPCR方法，能夠?qū)崿F(xiàn)兩種疾病的鑒別診斷。謝守玉等[41]建立了GPV、MDPV和鴨圓環(huán)病毒的多重TaqMan qPCR方法，對質(zhì)粒標準品的檢測限可達7.5×101copies/μL。

3.3.3 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術 LAMP是一種可以在恒溫條件下實現(xiàn)核酸快速擴增的技術。該技術靈敏性、特異性均較好，操作簡單，避免了傳統(tǒng)PCR方法溫度循環(huán)的種種不便，已經(jīng)被廣泛應用于病原微生物和傳染病診斷等多個領域。Ji等[42]針對MDPVVP3基因的6個特異性靶基因片段設計了引物，建立了LAMP檢測方法，可用于MDPV與其他鴨源病原，特別是GPV的鑒別診斷，其靈敏性較PCR方法提高了10倍。該方法對儀器要求較低，適用于沒有精確溫度控制器以及電泳和凝膠成像設備的現(xiàn)場或小規(guī)模實驗室。

3.3.4 重組酶介導等溫擴增技術（RAA） RAA是近年來新開發(fā)的恒溫核酸擴增技術。在恒溫條件下（37～42 ℃），重組酶、引物和單鏈結合蛋白形成復合物，當引物搜索到配對的DNA模板時，在DNA聚合酶的作用下合成新DNA鏈，僅需30 min即可完成對目的片段的快速擴增[43]。黃俊霖[44]針對MDPVVP1基因保守區(qū)域序列設計特異性引物，建立了基礎型RAA檢測方法，該方法特異性較好，靈敏度與PCR一致，耗時短、操作簡便，但較易造成氣溶膠污染，可能出現(xiàn)假陽性結果。

3.3.5 斑點雜交 斑點雜交是將待測DNA變性后點加在硝酸纖維素膜或尼龍膜上，經(jīng)標記的探針雜交后，通過顯影斑點的有無以及深淺判斷結果的檢測方法。該方法操作簡單，結果無需電泳或者轉(zhuǎn)印，可以直接在膜上顯示結果，是目前常用的分子生物學診斷技術。Le等[3]將使用與堿性磷酸酶綴合的抗地高辛抗體Fab片段，通過免疫酶反應檢測雜交的MDPV DNA探針，并通過化學發(fā)光反應觀察結果。該方法特異性及靈敏性均較好，最低檢測限可達3 fg。

4 疫苗

目前針對MDPV感染主要以疫苗預防為主，MDPV疫苗主要分為弱毒疫苗和滅活疫苗。其中，弱毒疫苗在使用過程中可能會出現(xiàn)毒力增強的現(xiàn)象，相比之下滅活疫苗或基因工程疫苗安全性更高。做好現(xiàn)有疫苗的優(yōu)化和新型疫苗的研發(fā)工作對于該病的防控尤為重要。陳少鶯等[45]將能使MDEF產(chǎn)生病變的GPV疫苗株和MDPV疫苗株按適當比例混合，制成了MDPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗，有效免疫期超過60 d，可以實現(xiàn)較好的免疫保護。程曉霞等[46]以MDPV弱毒株（MPV-P1株）和番鴨源GPV弱毒株（MDGPV-D株）為種毒，制備了MPV-GPV二聯(lián)活疫苗，可誘導雛番鴨產(chǎn)生良好的免疫應答，并在免疫后7 d能抵御強毒株攻擊。董嘉文等[47]將VP3基因和免疫刺激基序（CpG）克隆至真核表達質(zhì)粒pIRES-d IL2中，構建了MDPV疫苗質(zhì)粒，并成功在BHK-21細胞中表達，為MDPV核酸疫苗的研制奠定了基礎。

5 綜合防控

針對番鴨細小病毒病的防控，一是注重養(yǎng)殖場的生物安全防控體系建設。孵化、育雛、育成等各個區(qū)域需保持一定安全距離。引進種群需了解其健康狀況和疫苗免疫情況，并提前調(diào)查了解來源地鴨病的流行狀況。新入鴨群需隔離飼養(yǎng)，可對常見病進行抽檢，保證健康后可集中進行飼養(yǎng)或混養(yǎng)。二是保證環(huán)境衛(wèi)生，提高飼養(yǎng)管理水平。養(yǎng)殖場應保證圈舍及周圍環(huán)境的衛(wèi)生，做好定期消毒。需對人員和車輛出入進行嚴格把控，在大門口和養(yǎng)殖的不同區(qū)域設置相應消毒區(qū)，嚴格禁止閑雜人員進入養(yǎng)殖場。提高飼養(yǎng)管理水平，保證營養(yǎng)供給全面，避免出現(xiàn)飼料霉變和蟲鼠污染等情況。三是重視野鳥在疫病傳播中的作用。我國存在3條野鳥遷徙路線，野鳥在家禽疫病的傳播和流行中發(fā)揮著重要作用。姚雨欣[48]在大雁、白鷺、鶴類和雀類的腸道中均檢測到細小病毒科病毒，這提示要做好場舍的密閉式管理，減少養(yǎng)殖動物與野生鳥類接觸的機會。四是做好洗消工作。應特別注意孵化環(huán)節(jié)，尤其是冬春季節(jié)，在利用生石灰和雙氧水分別進行地面和環(huán)境及部分儀器消毒的同時，應注意環(huán)境通風，保證空氣新鮮。五是做好疫病監(jiān)測，推進疫病凈化工作。在做好免疫的同時，定期進行病毒檢測，尤其是祖代種群，應淘汰病原陽性個體，實現(xiàn)病原凈化。