翟今朝，卯云燁，李金鳳，董周寰，王玲兄，鄭 軒，葛祥偉，盧 迪，盛 舒，才巨星，秦嘉沛，王 安，胡 毅，汪進(jìn)良

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心腫瘤醫(yī)學(xué)部腫瘤內(nèi)科，北京 100071；3 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心腫瘤醫(yī)學(xué)部研究所，北京 100853；4 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心病理科，北京 100853

肺癌是世界上最致命和最常見(jiàn)的癌癥類型之一[1]。早期的肺癌患者以手術(shù)治療為主，但相當(dāng)一部分患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，從而影響患者生存。圍術(shù)期傳統(tǒng)的鉑類化療相比單純手術(shù)治療對(duì)ⅠB～ⅢA 期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的總生存期(overall survival，OS)提高僅約5%[2]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)出現(xiàn)之后，基于對(duì)晚期肺癌患者的顯著療效，早期可手術(shù)患者也可給予術(shù)前新輔助免疫治療[3-5]。三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(tertiary lymphoid structure，TLS)是在慢性炎癥(包括腫瘤)部位的非淋巴組織中發(fā)育的異位淋巴器官[6-7]。在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中TLS具有招募、活化和增殖T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞的功能，是腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的重要來(lái)源，可有效支持抗原呈遞和淋巴細(xì)胞活化[7-8]。TLS 的存在與多種癌癥的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低、生存期延長(zhǎng)以及提高對(duì)ICIs 的反應(yīng)有關(guān)[6,9-10]。有回顧性研究分析結(jié)直腸癌、乳腺癌、肉瘤和 NSCLC 的ICIs 治療前腫瘤樣本，具有成熟TLS 患者腫瘤客觀緩解率和OS 得到提高[11]。但目前通過(guò)組織學(xué)評(píng)估的TLS 并未顯示ICIs 應(yīng)答者的TLS 密度增加(與無(wú)應(yīng)答者相比)[12]。本研究通過(guò)組織學(xué)分析手術(shù)切除的肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)組織樣本，研究其TLS 特征，并分析其與LUSC 患者生存預(yù)后及新輔助免疫治療的關(guān)系，為TLS 預(yù)測(cè)患者生存預(yù)后及新輔助免疫治療療效提供參考。

資料與方法

1 臨床資料 該研究是一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究，納入2015-2022年解放軍總醫(yī)院18 例經(jīng)新輔助免疫治療后經(jīng)根治性切除的LUSC 患者臨床資料，同時(shí)納入2010-2018年解放軍第一四八醫(yī)院24 例未經(jīng)新輔助治療經(jīng)根治性切除的LUSC 患者臨床資料。本研究通過(guò)解放軍總醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審核同意(倫審第S2019-228-02 號(hào))。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)行LUSC 根治性切除術(shù)且病理診斷為原發(fā)性LUSC；(2)術(shù)前未行化療、放療；(3)經(jīng)新輔助免疫治療患者術(shù)前接受標(biāo)準(zhǔn)化療聯(lián)合抗PD-1/PD-L1 抑制劑2 周期以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和其他癌癥；(2)醫(yī)療記錄和隨訪信息不完整。

3 TLS 定義及特征分析 TLS 定義為非淋巴組織部位的異位淋巴結(jié)構(gòu)，最小可接受直徑200 μm，最小可接受所含淋巴細(xì)胞100 個(gè)，最小可接受淋巴細(xì)胞密度0.005/μm2[淋巴聚集體中所含淋巴細(xì)胞數(shù)/淋巴聚集體面積(μm2)]。記錄TLS 中淋巴細(xì)胞密度、TLS 最大面積和TLS 密度(切片組織TLS數(shù)量與組織面積比值)等TLS 相關(guān)特征，并根據(jù)形狀將其分為圓形/橢圓形和非規(guī)則形狀兩類。

4 分析指標(biāo) (1) TLS 特征：根據(jù)軟件細(xì)胞分類分析TLS 細(xì)胞密度、平均TLS 密度、TLS 面積、高/低細(xì)胞密度TLS 密度(0.0097/μm2)、圓形/橢圓形TLS 密度、非規(guī)則型TLS 密度等。以中位數(shù)劃分高、低組比較臨床指標(biāo)的差異。(2)新輔助治療療效與TLS 特征的關(guān)系：以腫瘤最佳緩解深度[腫瘤退縮程度(%)]評(píng)價(jià)療效。(3) OS 與TLS 特征的關(guān)系?；颊唠S訪時(shí)間自手術(shù)日開(kāi)始至患者死亡或最后一次隨訪結(jié)束(2022年12月)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSSAU 23.0 在線應(yīng)用軟件[14-15]和R (4.2.1)版本中R 包stats (4.2.1)、car、ggalluvial (0.12.3)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析TLS 特征與臨床指標(biāo)的關(guān)系，采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析組間差異性，生存分析采用Kaplan-Meier 分析，結(jié)果用ggplot2 (3.3.6)包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 患者一般資料 本研究納入42 例接受LUSC根治性切除術(shù)的患者。中位年齡65(范圍：50～81)歲，男性40 例(95.24%)，女性2 例(4.76%)。中位隨訪時(shí)間23.5(4～83)個(gè)月，其中新輔助免疫治療患者18 例。見(jiàn)表1。

表1 患者的臨床特征(例，%)Tab.1 Baseline characteristics of the patients (n,%)

2 癌組織細(xì)胞分析 通過(guò)QuPath 軟件分析檢測(cè)細(xì)胞、人工注釋及訓(xùn)練分類將檢測(cè)細(xì)胞分為腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、其他細(xì)胞(包含纖維細(xì)胞、壞死區(qū)細(xì)胞、紅細(xì)胞及其他基質(zhì)區(qū)細(xì)胞)和可忽略細(xì)胞(組織異常污染區(qū)、軟骨細(xì)胞和未被納入檢測(cè)的細(xì)胞)。病理組織細(xì)胞分類以柱狀圖呈現(xiàn)，經(jīng)新輔助免疫治療患者相比未經(jīng)新輔助治療患者的TLS 所含免疫細(xì)胞明顯增多。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞分類柱狀圖1～18 為經(jīng)新輔助免疫治療患者，a～z 為未經(jīng)新輔助治療患者Fig.1 Cell classification histogram Serial numbers 1 to 18 represented cells from patients treated with neoadjuvant immunotherapy,a to z represented cells from patients without neoadjuvant treatment

3 TLS 特征與臨床指標(biāo)的關(guān)系 以腫瘤組織檢測(cè)TLS 密度(0.088/mm2)、圓形/橢圓形TLS 密度(0.013/mm2)、高細(xì)胞密度TLS(0.013/mm2)、最大TLS 面積(0.20 mm2)的中位數(shù)，將對(duì)應(yīng)的資料/患者進(jìn)行兩分類/分組，分別列示于表2、表3、表4、表5。經(jīng)比較知：較高的TLS 密度與新輔助免疫治療具有相關(guān)性(P＜0.001)，并與新輔助免疫治療緩解深度≥60%組具有相關(guān)性(P=0.007)(表2)；圓形/橢圓形TLS 密度在N 分期(P=0.025)、M 分期(P=0.038)方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且密度＞0.013/mm2組與新輔助免疫治療具有顯著相關(guān)性(P=0.013)(表3)；3 周期以上的新輔助免疫治療與較低密度的高細(xì)胞密度TLS 有關(guān)(P=0.024)(表4)；年齡＜65 歲組最大TLS 面積大于年齡≥65 歲組(P=0.019)，并且最大TLS 面積在腫瘤分化程度中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)(表5)。

表2 TLS 密度與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系(例，%)Tab.2 Relationship between density of TLS and clinical indicators (n,%)

表4 高細(xì)胞密度TLS 與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系(例，%)Tab.4 Relationship between high-cell-density TLS and clinical indicators (n,%)

4 免疫治療療效與TLS 的關(guān)系 LUSC 患者經(jīng)2 周期以上新輔助免疫治療患者1 例達(dá)完全緩解(complete response，CR)、13 例為部分緩解 (partial response，PR)、4 例為疾病穩(wěn)定 (stable disease，SD)，7 例術(shù)后行輔助免疫治療，3 例出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)，無(wú)死亡事件發(fā)生。

腫瘤最佳緩解深度≥60%相比＜60%者，TIL密度(792.13/mm2vs410.56/mm2，P=0.032)、TLS 密度(0.20/mm2vs0.09/mm2，P=0.018)、TLS 中位面積(70010 μm2vs47040 μm2，P=0.014)顯著增高，低細(xì)胞密度TLS(0.106/mm2vs0.032/mm2，P=0.001)、非規(guī)則TLS(0.164/mm2vs0.064/mm2，P=0.014)同樣顯著增高；同時(shí)TLS 平均細(xì)胞數(shù)(1111vs629，P=0.083)、高細(xì)胞密度TLS(0.113/mm2vs0.020/mm2，P=0.206)、圓形/橢圓形TLS 相對(duì)增高(0.039/mm2vs0.013/mm2，P=0.083)。見(jiàn)圖2。

由電機(jī)通過(guò)齒輪帶動(dòng)頂部的盤面回轉(zhuǎn)，一組模子放置在盤面的邊緣；為使模子可方便地翻轉(zhuǎn)從而取出限陽(yáng)極板，采用如下方式：模子兩邊各帶一個(gè)軸頭，軸頭分別裝入帶座軸承，并隨之固定在盤面上，另外設(shè)置一個(gè)不連接的支點(diǎn)，這樣既可使模子保持水平，又可方便地翻轉(zhuǎn)模子。在設(shè)計(jì)過(guò)程中，還采用了其它各種措施，使得回轉(zhuǎn)盤結(jié)構(gòu)緊湊，且運(yùn)行平穩(wěn)。

圖2 經(jīng)新輔助免疫治療患者TLS 特征分析(小提琴圖)Fig.2 Characterization of TLS in patients treated with neoadjuvant immunotherapy (violin plot)

5 未經(jīng)新輔助治療患者TLS 特征與生存分析 未經(jīng)新輔助治療的患者中23 例達(dá)到死亡終點(diǎn)，失訪1 例，中位OS 為40 個(gè)月；OS≥3年患者相較于＜3年患者，TLS 密度(0.078/mm2vs0.052/mm2，P=0.042)、圓形/橢圓形TLS 密度(0.015/mm2vs0.005/mm2，P=0.046)更高。Kaplan-Meier 生存分析顯示TLS 密度較高組相較于較低組死亡風(fēng)險(xiǎn)降低36%[mOS：40 個(gè)月vs23.5 個(gè)月；HR(95%CI)：0.64(0.26～1.54) ；P=0.316]，圓形/橢圓形TLS 密度較高組相較于較低組具有相對(duì)更好的預(yù)后[mOS：53.5 個(gè)月vs25.0 個(gè)月；HR(95%CI)：0.44(0.18～1.06)；P=0.069]，最大TLS 面積高組相較于低組具有相對(duì)更佳的預(yù)后并降低死亡風(fēng)險(xiǎn)54%[mOS：50.0 個(gè)月vs25.0 個(gè)月，HR(95%CI)：0.46(0.19～1.08) ；P=0.074]。見(jiàn)圖3。

圖3 不同TLS 特征組生存分析A：OS≥3年與＜3年患者TLS 特征分析(小提琴圖) ；B、C 和D：TLS 密度(B)、最大TLS 面積(C)、圓形/橢圓形TLS 密度(D)的Kaplan-Meier 生存分析Fig.3 Survival analysis by TLS characteristics A:Analysis of TLS characteristics in patients with OS≥3 years vs OS＜3 years (violin plot);B,C and D:Kaplan-Meier analysis of the density of TLS (B),the area of maximum TLS (C),and the density of round/elliptical TLS (D)

討 論

TLS 是慢性炎癥和免疫刺激下發(fā)生在非淋巴組織(如TME)中的淋巴樣新生[9,16]，對(duì)TLS 的檢測(cè)主要通過(guò)對(duì)病理切片的免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)進(jìn)行分析，這對(duì)于明確TLS 的存在很有價(jià)值。然而，IHC 的TLS 切片分析也存在一些局限性，如臨床樣本資源消耗過(guò)多、定量分析不便、TME 聯(lián)合分析復(fù)雜等[6,17]。既往研究是根據(jù)高內(nèi)皮小靜脈、樹(shù)突狀細(xì)胞和其他標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)確定TLS 的密度，但根據(jù)我們的診斷經(jīng)驗(yàn)，這可能低估了TLS 的密度。因此我們的研究使用HE 染色的組織病理學(xué)載玻片和開(kāi)源組織病理學(xué)圖像分析軟件QuPath 分析接受新輔助免疫治療LUSC 患者的TLS 特征變化。本研究首次針對(duì)TLS 特征分類，并對(duì)高/低細(xì)胞密度TLS、最大TLS 面積和TLS 密度等特征進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

既往研究證明，TLS 中的某些細(xì)胞亞型在黑色素瘤和腎細(xì)胞癌免疫治療反應(yīng)中起重要作用，其中免疫治療應(yīng)答組中參與B 細(xì)胞功能和TLS 密度變化的基因表達(dá)顯著增加[18]。包括NSCLC、結(jié)腸癌、乳腺癌在內(nèi)對(duì)免疫治療應(yīng)答的患者具有更高的腫瘤TLS 特征，而具有高TLS 特征的患者具有更高的總生存率[11,19]。在本研究中同樣證明生存3年以上的患者TLS 密度、圓形/橢圓形TLS 密度、最大TLS 面積患者相對(duì)更高，降低了死亡風(fēng)險(xiǎn)。

有研究表明最大TLS 直徑與預(yù)后存在相關(guān)性，可以作為預(yù)后指標(biāo)[20]，但在實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，最大TLS 直徑可能受限于非規(guī)則型TLS 的形狀，無(wú)法特異性代表TLS 特征。本研究中發(fā)現(xiàn)新輔助免疫治療3 周期以上患者相較于新輔助治療2 周期患者高細(xì)胞密度TLS 密度相對(duì)降低；一項(xiàng)瑞士的研究表明，在未經(jīng)治療的LUSC 患者中，TLS 密度是最強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。然而在新輔助化療后，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TLS 密度的增加，反而造成生發(fā)中心(germinal center，GC)形成受損，導(dǎo)致TLS 密度的預(yù)后價(jià)值喪失[18]。另外一項(xiàng)來(lái)自中國(guó)的研究同樣表明，重復(fù)使用5-氟尿嘧啶會(huì)影響腫瘤免疫環(huán)境，而長(zhǎng)期化療會(huì)損害抗腫瘤免疫力[21]。本研究首次將LUSC 新輔助免疫治療患者納入TLS 分析中，并且發(fā)現(xiàn)對(duì)免疫治療應(yīng)答患者TLS數(shù)量和密度顯著增加、TLS 細(xì)胞密度增高、最大TLS 面積增高等特點(diǎn)，但因無(wú)法獲得治療前標(biāo)本，故不能排除在治療前TLS 已形成。

本研究采用半自動(dòng)化分析細(xì)胞，標(biāo)記組織淋巴聚集區(qū)，在我們的研究中TLS 最小納入密度為0.005/μm2，所有TLS 平均淋巴細(xì)胞密度0.011/μm2，這遠(yuǎn)高于非TLS 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密度，與既往研究基本相符[22]。經(jīng)新輔助免疫治療患者的腫瘤微環(huán)境有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，其中參與形成TLS 的免疫細(xì)胞比例顯著增加，促進(jìn)TLS 形成。與此同時(shí)，新輔助免疫治療與更高的TLS 密度、最大TLS 面積、TLS 平均細(xì)胞密度等特征有顯著相關(guān)性。

TLS 在實(shí)體瘤中的形成和功能尚未得到徹底解釋。既往研究中，TLS 被認(rèn)為是成熟且緊密堆積的淋巴細(xì)胞，形成具有光滑圓形輪廓的離散實(shí)體，并且可以處于不同的成熟階段(即淋巴聚集體或具有GC 的聚集體)[7,12,23]。本研究將TLS 按照形狀分類，分為圓形/橢圓形和非規(guī)則形，圓形/橢圓形TLS 平均淋巴細(xì)胞密度為0.012/μm2，高于非規(guī)則TLS 細(xì)胞密度0.010/μm2，研究表明對(duì)新輔助免疫治療具有較高應(yīng)答的患者圓形/橢圓形TLS 密度顯著增多，比例顯著提高。

在一項(xiàng)來(lái)自倫敦大學(xué)的研究中，以HE 染色載玻片為基礎(chǔ)，將TLS 區(qū)域淋巴細(xì)胞密度納入研究，提出應(yīng)將TLS 最小面積、TLS 最小淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞密度作為TLS 定義標(biāo)準(zhǔn)[24]。本研究中發(fā)現(xiàn)新輔助免疫治療緩解深度≥60%患者相較于緩解深度＜60%患者具有更高的TLS 密度、TLS 中位面積、TLS 平均細(xì)胞數(shù)、低細(xì)胞密度和非規(guī)則TLS 密度，在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)非規(guī)則TLS 具有直徑長(zhǎng)、周長(zhǎng)長(zhǎng)、面積大、細(xì)胞密度相對(duì)低等組織學(xué)特點(diǎn)，這樣的特點(diǎn)在一定程度上增大了TLS 與腫瘤組織的接觸面積和接觸機(jī)會(huì)，同樣在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。

TLS 是抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要參與者，其在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的相互關(guān)系和各自的動(dòng)力學(xué)也有待破譯。TLS 的存在或其在癌癥治療后的誘導(dǎo)形成通常與有利的臨床結(jié)局相關(guān)并可預(yù)測(cè)治療效果。對(duì)TLS 及其在ICIs 治療中的積極作用的認(rèn)識(shí)在不斷提高，對(duì)于TLS 形成和構(gòu)成的深入研究將有助于進(jìn)一步闡明TME 中的分子機(jī)制。目前，TLS 的B 細(xì)胞相關(guān)通路，即CXCL13/CXCR5 軸和CCL19/CCL21/CCR7 軸，被廣泛研究[22,25-26]。誘導(dǎo)TLS 的形成和通過(guò)TLS 抑制腫瘤發(fā)生有望成為未來(lái)研究方向。通過(guò)各種藥理學(xué)方法誘導(dǎo)TLS 形成并聯(lián)合ICIs、腫瘤疫苗、溶瘤病毒、局部瘤內(nèi)抑制劑或干預(yù)療法等已成為增加冷腫瘤對(duì)ICIs 敏感性的新型手段。相反，在有強(qiáng)烈慢性炎癥、血管生成和纖維化基質(zhì)的TME 紊亂熱腫瘤中，使用抗血管生成聯(lián)合ICIs 治療可能有助于使TME 質(zhì)地正常化，有利于TLS 形成和提高對(duì)ICIs 的治療療效。TLS 和相應(yīng)B 細(xì)胞通路可能成為T 細(xì)胞治療革命時(shí)代的新型抗腫瘤靶點(diǎn)代表[27-29]。

總體而言，盡管用于量化TLS 的方法存在異質(zhì)性，但大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)TLS 密度與多種不同類型癌癥患者的生存期具有相關(guān)性。我們的研究也證實(shí)對(duì)于免疫治療應(yīng)答較好的患者具有更高TLS 密度，但因本研究中18 例經(jīng)新輔助免疫治療手術(shù)切除患者僅有3 人達(dá)到疾病復(fù)發(fā)，因此本研究缺少新輔助免疫治療生存分析結(jié)果證明TLS 密度對(duì)免疫治療生存預(yù)后的預(yù)測(cè)作用。

本研究具有一定的局限性：(1)因新輔助免疫治療方式的局限，研究的病例數(shù)量較少；(2)作為回顧性研究，對(duì)于進(jìn)一步的研究，有必要通過(guò)積累大量多中心病例來(lái)闡明新輔助免疫治療促進(jìn)TLS 成熟的機(jī)制，如對(duì)TLS 形態(tài)學(xué)的研究、GC樣結(jié)構(gòu)的分析、TLS 位置與腫瘤邊緣關(guān)系、TLS形成與高內(nèi)皮靜脈的關(guān)系等；(3)對(duì)于TLS 密度的定義和量化仍缺少科學(xué)證據(jù)，需進(jìn)一步研究探索。

致謝特別感謝中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院腎臟疾病實(shí)驗(yàn)室對(duì)實(shí)驗(yàn)給予的特別協(xié)助，感謝陳彤和張王靜怡給予的寶貴意見(jiàn)和無(wú)私幫助。

作者貢獻(xiàn)翟今朝：課題實(shí)施，研究結(jié)果驗(yàn)證，軟件處理，可視化數(shù)據(jù)處理，文章撰寫；汪進(jìn)良：課題主要設(shè)計(jì)、研究目的、研究結(jié)果審核，文章的評(píng)閱和修訂工作；胡毅：課題主要設(shè)計(jì)、研究結(jié)果審核，研究思路，文章的評(píng)閱和修訂工作；卯云燁：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)，修改初稿；李金鳳：收集臨床數(shù)據(jù)信息，隨訪；董周寰：組織切片的染色和分析；王玲兄：切片數(shù)據(jù)分析及可視化；葛祥偉、秦嘉沛：細(xì)胞分類標(biāo)識(shí)，構(gòu)建細(xì)胞分類器，TLS 標(biāo)記的審閱與修正；盧迪：圖像的特異性標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)分析；盛舒：初始數(shù)據(jù)的提取和整理；才巨星：初始數(shù)據(jù)的維護(hù)、篩選、隨訪；王安：臨床數(shù)據(jù)的分析與整理；鄭軒：數(shù)據(jù)分析和可視化的審核。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)有意使用或查驗(yàn)者須向作者提供數(shù)據(jù)訪問(wèn)申請(qǐng)，得到作者授權(quán)或同意后，才能獲取數(shù)據(jù)文件。Email：zhai jinzhao301@foxmail.com。