顧達(dá) 童聰 王維釗 向曉星 趙祥安

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范圍內(nèi)一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,隨著核苷(NAs)抗病毒藥物的發(fā)展,慢性乙型肝炎的治療取得了顯著進(jìn)展[1]。然而現(xiàn)有的抗病毒治療方案不能完全清除病毒,同時(shí)個(gè)體差異也導(dǎo)致了抗病毒療效的不確定性和不可預(yù)測(cè)性[2]。因此,篩選能夠預(yù)測(cè)抗病毒療效的細(xì)胞因子成為了目前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)許多白細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子被確定參與對(duì)HBV感染的免疫反應(yīng)[3]。其中白細(xì)胞介素(IL)-10備受關(guān)注,IL-10是一種有效的免疫和炎癥抑制劑,在慢性HBV感染引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[4]。最近的研究表明,IL-10/HBV DNA比率能夠預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎(CHB)患者對(duì)IFN-α治療的反應(yīng)[5]。然而目前對(duì)于NAs治療過(guò)程中IL-10表達(dá)的變化以及抗病毒療效的預(yù)測(cè)研究仍較少。因此,本研究調(diào)查不同免疫狀態(tài)的CHB患者血清IL-10水平,并進(jìn)一步觀察乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽(yáng)性患者接受抗病毒治療后長(zhǎng)期隨訪期間血清IL-10水平的變化。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2008年5月—2013年9月于江蘇省蘇北人民醫(yī)院和南京鼓樓醫(yī)院傳染病科就診的90例CHB患者作為研究對(duì)象。CHB的納入標(biāo)準(zhǔn)參考《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》,即血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月、排除合并其他肝炎病毒和嚴(yán)重并發(fā)癥的患者,如失代償性肝硬化、肝癌和肝衰竭。此外選取10名健康獻(xiàn)血者作為對(duì)照。所有入選患者均簽署知情同意書,并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、分組

根據(jù)是否診斷為CHB分為健康對(duì)照(HC)組和CHB組;根據(jù)美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)(AASLD)的指南實(shí)踐標(biāo)準(zhǔn)將慢性HBV感染分為四組:非活動(dòng)攜帶者(IC)組、免疫耐受(IT)組、HBeAg陽(yáng)性CHB(EPH)組和HBeAg陰性CHB(ENH)組,其中IC組6人、IT組22人、EPH組44人和ENH組18人,同時(shí)納入健康對(duì)照10人。

三、抗病毒治療和隨訪

給予30例HBeAg陽(yáng)性CHB患者NAs抗病毒治療,包括:拉米夫定、替比夫定、阿德福韋酯和恩替卡韋。治療標(biāo)準(zhǔn)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》:HBsAg陽(yáng)性、HBeAg陽(yáng)性、HBV DNA>2 000 IU/mL、ALT>40 U/L。收集CHB患者抗病毒治療后第0周、第4周、第12周、第24周和第48周血清,檢測(cè)血清ALT、HBV DNA和IL-10水平。隨訪該群患者,觀察抗病毒治療后2年、3年和5年血清HBeAg是否轉(zhuǎn)陰,并將其分為HBeAg轉(zhuǎn)陰組和HBeAg仍陽(yáng)性組。

四、血清ALT、HBV DNA、HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)

利用雅培試劑盒檢測(cè)血清ALT水平。使用TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)HBV DNA(杭州愛(ài)康生物技術(shù)有限公司)。使用德國(guó)威斯巴登雅培股份有限公司和KG公司試劑盒檢測(cè)血清HBsAg、乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)、乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)、HBeAg和乙型肝炎e抗體(抗-HBe)進(jìn)行病毒學(xué)分析。

五、血清IL-10檢測(cè)

使用Luminex試劑盒(美國(guó)Milliplex MAP公司)檢測(cè)所有納入病例基線血清IL-10水平,以及接受抗病毒的患者治療后第4周、12周、24周、48周的血清IL-10水平。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的資料用中位數(shù)(四分位間距)表示,兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。對(duì)于多組比較,符合方差齊性的計(jì)量資料采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,不符合方差齊性的計(jì)量資料采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行分析。相關(guān)分析中,服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Pearson相關(guān)分析,不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Sperman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、納入病例的基線特征和血清IL-10對(duì)比

本研究共納入90例CHB患者和10例健康受試者。CHB患者的中位年齡為28歲(IQR,23～37歲),72.22%為男性。血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg中位數(shù)分別為(7.18±0.13)log10IU/mL、(22 224.38±3 202.16) IU/mL和(1 001.06±73.12) S/CO。健康受試者血清ALT水平的中值為(17.00±2.93) U/L,CHB患者為(133.19±14.62) U/L。與健康受試者的血清IL-10水平相比,CHB患者的血清IL-10水平顯著升高[(0.81±0.24) vs (7.55±2.18) pg/mL,P<0.01)]。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象的基線特征

二、不同免疫狀態(tài)下IL-10表達(dá)的比較

IC組(n=6)、IT組(n=22)、EPH組(n=44)和ENH組(n=18)的基線血清學(xué)和病毒學(xué)特征如表2所示。IC組的血清IL-10水平顯著低于IT組、EPH組和ENH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 慢性HBV感染不同時(shí)期基線血清學(xué)和病毒學(xué)特征

三、EPH患者抗病毒治療后血清ALT、HBV DNA、IL-10水平的變化

30例HBeAg陽(yáng)性CHB患者(HBV DNA>2000 IU/mL,ALT>40 U/L)接受NAs抗病毒治療,其中阿德福韋酯2例,拉米夫定1例,拉米夫定+阿德福韋酯16例,替比夫定2例,恩替卡韋11例。檢測(cè)NAs治療后第4周、第12周、第24周和第48周的血清IL-10水平。如表3所示,抗病毒治療后,血清HBV DNA和ALT水平顯著降低,IL-10也逐漸下降。

表3 EPH患者抗病毒治療48周后血清血清學(xué)、病毒學(xué)和生化指標(biāo)的變化

四、抗病毒治療后HBeAg仍陽(yáng)性和轉(zhuǎn)陰組的基線血清HBeAg和IL-10對(duì)比

30例HBeAg陽(yáng)性的CHB患者接受核苷類似物抗病毒治療,隨訪5年。結(jié)果顯示,在抗病毒治療2年內(nèi)8例患者實(shí)現(xiàn)了HBeAg轉(zhuǎn)陰,3年內(nèi)9例患者實(shí)現(xiàn)了HBeAg轉(zhuǎn)陰,5年內(nèi)12例患者實(shí)現(xiàn)了HBeAg轉(zhuǎn)陰。如表4所示,根據(jù)HBeAg是否轉(zhuǎn)陰,將接受抗病毒治療的患者分為HBeAg轉(zhuǎn)陰組和HBeAg仍陽(yáng)性組。分析發(fā)現(xiàn),與HBeAg仍然陽(yáng)性的患者相比,在2年內(nèi)和3年內(nèi)HBeAg轉(zhuǎn)陰患者擁有更低的基線血清HBeAg水平[(416.2±214.4) vs (905.6±105.9)S/CO,P=0.039;(362.0±189.1) vs (1 220.0±125.9) S/CO,P=0.013]。同時(shí)分析發(fā)現(xiàn),與HBeAg仍然陽(yáng)性的患者相比,在2年內(nèi)、3年內(nèi)和5年內(nèi)HBeAg轉(zhuǎn)陰患者的基線血清IL-10水平較高[(6.49±2.16)vs (3.33±1.22) pg/mL,P=0.062;(5.88±1.99) vs (2.27±1.36) pg/mL,P=0.026;(6.01±1.91) vs (1.15±0.63) pg/mL,P=0.027]。

表4 HBeAg仍陽(yáng)性和轉(zhuǎn)陰組的基線血清HBeAg和IL-10水平對(duì)比

討 論

IL-10由Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞和B細(xì)胞分泌,是一種免疫調(diào)節(jié)和抗炎反應(yīng)中的免疫抑制細(xì)胞因子[6]?？梢种凭奘杉?xì)胞的抗原遞呈功能、多種促炎細(xì)胞因子的功能,如IL-17和IL-21、Th-1細(xì)胞反應(yīng)和效應(yīng)T細(xì)胞增殖[2,7]。大量研究表明,IL-10影響HBV的清除[3-4]。Jiao等[8]研究已證實(shí),CHB患者的血清IL-10明顯高于正常人。Wang等[9]發(fā)現(xiàn), CHB患者的血清IL-10+ Breg和Tfr細(xì)胞數(shù)量明顯高于健康對(duì)照組。同時(shí),我們的研究表明,CHB患者血清IL-10水平明顯高于正常人,這可能與HBV持續(xù)感染密切相關(guān)。

CHB根據(jù)病毒載量和宿主免疫力表現(xiàn)出不同生化特征的動(dòng)態(tài)過(guò)程[10-11],可分為不同的疾病階段:IC、IT、EPH和ENH。因此,我們進(jìn)一步分析了慢性HBV感染患者的不同疾病階段,發(fā)現(xiàn)IC期的IL-10水平低于其他三個(gè)階段,包括EPI、ENH和EPH期。這些結(jié)果與以前的研究一致[10-11]。

NAs抗病毒藥物可有效抑制CHB患者的HBV復(fù)制[12]。肝細(xì)胞感染病毒的減少也可能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和IL-10分泌減少[13]。在本研究中,40%的EPH患者在抗病毒治療12周后未檢測(cè)到HBV DNA水平,而95%的EPH患者在抗病毒治療48周后未檢測(cè)到HBV DNA水平。同時(shí),抗病毒治療12周后,血清IL-10和ALT水平顯著降低。Boni等[14]發(fā)現(xiàn),拉米夫定可以降低CHB患者的病毒載量和IL-10表達(dá)。Yu等[15]檢測(cè)了CHB患者服用阿德福韋醋酸酯后IL-10的表達(dá)水平,結(jié)果顯示服用阿德福韋酯12個(gè)月后HBV DNA載量下降,同時(shí)IL-10表達(dá)下降。抗病毒治療可以改善CHB患者的免疫狀態(tài)。

個(gè)體差異可能導(dǎo)致抗病毒療效的不確定性和不可預(yù)測(cè)性[2]。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)抗病毒療效的血清學(xué)指標(biāo)一直是CHB患者的研究熱點(diǎn)[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn),IL-10與慢性丙型肝炎和CHB患者的抗病毒療效密切相關(guān)。Yan等已經(jīng)證明,IL-10/HBV DNA是CHB患者對(duì)IFN-α治療反應(yīng)較佳的預(yù)測(cè)因子[5]。他們還發(fā)現(xiàn),在CHB患者中,IL-10對(duì)ETV誘導(dǎo)的HBV復(fù)制抑制更為敏感[11]。在本研究中,我們隨訪了30例在第2年、第3年和第5年接受抗病毒治療的EPH患者,結(jié)果顯示,與HBeAg仍然陽(yáng)性的患者相比,HBeAg轉(zhuǎn)陰患者的IL-10水平顯著降低。

綜上,本研究表明,CHB患者血清IL-10水平顯著升高,經(jīng)過(guò)抗病毒治療后IL-10明顯降低;同時(shí),血清IL-10水平的變化可能是預(yù)測(cè)抗病毒治療結(jié)果的潛在生物標(biāo)志物。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。