李金昌，王俊壹，張其德，顧萬(wàn)建（江蘇省中醫(yī)院.檢驗(yàn)科，.腫瘤科，.消化內(nèi)鏡中心，南京 210029）

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，每年新發(fā)胃癌病例中早期胃癌占比僅為20%，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時(shí)已至進(jìn)展期，總體5 年生存率不足50%［1］。為提高早期診斷水平，無(wú)創(chuàng)、方便快捷、便于大規(guī)模篩查的血清學(xué)新型腫瘤標(biāo)志物有待被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。近年來(lái)報(bào)道，血清外泌體miRNAs 有望作為腫瘤診斷的候選生物學(xué)標(biāo)志物［2］。miR-494-3p 在多種腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮著不同的調(diào)控作用，例如其在肝細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)控脂質(zhì)生物合成促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［3］；miR-494-3p 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)，且低表達(dá)患者的生存率較低［4］。研究表明，前體miR-494 在胃癌組織中呈低表達(dá)，并對(duì)胃癌細(xì)胞具有抑制作用［5］；但關(guān)于miR-494-3p 在胃癌組織及其血清外泌體中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)miR-494-3p 在胃癌患者組織和血清外泌體中的表達(dá)水平，并分析其對(duì)胃癌篩查及輔助鑒別診斷的價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019 年1 月至2021 年12 月江蘇省中醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心就診的胃癌患者經(jīng)手術(shù)切除的新鮮胃癌組織14 例作為胃癌組，其中男9例，女5 例，年齡（64.6±6.8）歲，Ⅰ／Ⅱ期6 例，Ⅲ期8例，腫瘤大?。? cm 7 例，≤3 cm 7 例；收集同期因胃炎或胃息肉等胃部良性疾病行胃鏡活檢的新鮮胃組織16 例作為相關(guān)疾病對(duì)照組，其中男4 例，女12 例，年齡（46.9±11.7）歲；另收集同期門(mén)診就診的44 例胃癌患者的血清標(biāo)本，其中男32 例，女12 例，年齡（67.9±7.9）歲；以及同期體檢健康者的血清標(biāo)本，其中男32 例，女12 例，年齡（68.0±7.9）歲。胃癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胃癌組織樣本為手術(shù)切除且經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷，患者術(shù)前未經(jīng)放化療治療；（2）胃癌血清樣本來(lái)源為本院門(mén)診就診的胃癌患者（經(jīng)本院或他院內(nèi)鏡或活檢確診），收集血清時(shí)未經(jīng)放化療或手術(shù)治療。胃癌組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他良惡性腫瘤；（2）合并免疫系統(tǒng)疾??；（3）合并心肝腎嚴(yán)重功能不全；（4）樣本取樣量少、溶血等樣本不符合實(shí)驗(yàn)要求。胃癌患者診斷和分期符合胃癌診療指南（2022 年版）［1］。本研究通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（江蘇省中醫(yī)院）倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（2018NL-KS18），研究對(duì)象均知情同意。

1.2 主要儀器和試劑 ExoQuickTMExosome Isolation Reagent（EXOQ5A-1）血清外泌體提取試劑盒（美國(guó)SBI 公司），QuantstudioTMDX 定量PCR 儀、TRlzol 試劑、Taqman 探針?lè)≒CR 預(yù)混液、TaqmanTMmiRNA assay（hsa-miR-494-3p／hsa-miR-16／cel-miR-39探針引物設(shè)計(jì)與合成）購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，外參線(xiàn)蟲(chóng)cel-miR-39（序列為UCACCGGUGUAAAUCAGCU UG，南京瑞真生物公司），反轉(zhuǎn)錄試劑（日本TaKaRa公司），NanoDrop2000 微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher 公司），氯仿、無(wú)水乙醇（上海久億化學(xué)試劑有限公司），無(wú)核酶水（南京凱基生物公司）。

1.3 組織總RNA 提取 取-80 ℃冷凍保存的組織塊，稱(chēng)取約50 mg，用干凈消毒的剪刀剪碎，加入TRlzol 試劑裂解后，按照說(shuō)明書(shū)采用氯仿、無(wú)水乙醇等提取總RNA，提取的總RNA 溶解于20 μL 無(wú)核酶水，NanoDrop2000 微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，取吸光度（A260nm／A280nm）值在1.8～2.0之間且濃度＞25 μg／μL 的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，樣本置于-80 ℃保存。

1.4 血清外泌體的提取、鑒定及外泌體RNA 的提取 按照SBI 外泌體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行外泌體提取，取冷凍保存的血清樣本恢復(fù)至室溫，3 000×g離心15 min 去除細(xì)胞和碎片，在干凈無(wú)菌的1.5 mL 離心管中加入200 μL 血清和50 μL 外泌體提取試劑充分顛倒混勻，4 ℃靜置30 min，1 500×g離心30 min 后棄上清液，1 500×g離心5 min 后用移液器輕輕吸去殘余上清液，底部沉淀即為獲取的外泌體，用200 μL 無(wú)核酶水溶解，4 ℃短時(shí)間冷藏保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。重懸的外泌體溶液外送至南京中鏡科儀技術(shù)有限公司用于透射電鏡拍攝和粒徑分析以鑒定外泌體。外泌體懸液中加入等量TRlzol 試劑裂解，每份樣本加入1 μL 線(xiàn)蟲(chóng)cel-miR-39（工作濃度20 nmol／L）作為外部參照，后續(xù)按TRlzol 試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA（純度和濃度的檢測(cè)、樣本要求及保存條件同上述組織樣本）。

1.5 反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增 對(duì)于上述提取的總RNA，采用Taqman 探針?lè)?，按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照ABI 定量PCR 試劑盒和QuantstudioTMDX 定量PCR 儀說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。探針?lè)╭PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括：PCR Mix 預(yù)混液10 μL，TaqMan酶1 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 2 μL，無(wú)核酶水7 μL。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，45 個(gè)循環(huán)。采用QuantstudioTMDX 定量PCR 儀自帶分析軟件于60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，自動(dòng)計(jì)算循環(huán)閾值（Ct）。組織樣本后續(xù)qPCR 以has-miR-16作為內(nèi)部參照，血清樣本后續(xù)qPCR 以線(xiàn)蟲(chóng)cel-miR-39 作為外部參照，miR-494-3p 的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)內(nèi)參或者外參標(biāo)準(zhǔn)化后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt＝（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3 次，取均值Ct。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad prism 8.0 軟件作圖，SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，基因表達(dá)量用表示，各組數(shù)據(jù)比較前均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合方差齊性的兩組均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（雙尾），方差不齊的兩組數(shù)據(jù)差異比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)。采用ROC 曲線(xiàn)分析并評(píng)估目標(biāo)基因?qū)膊〉脑\斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者和健康人對(duì)照組血清外泌體miR-494-3p的相對(duì)表達(dá)水平比較 與健康人對(duì)照組（1.00±0.36）相比，胃癌組血清外泌體miR-494-3p 的相對(duì)表達(dá)水平（0.21±0.03）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝3.64，P＜0.01）；胃癌患者血清外泌體miR-494-3p的表達(dá)水平在不同性別組（男性組和女性組分別為0.25±0.04 和0.12±0.03，t＝1.91，P＝0.06）、年齡組（＜70 歲組和≥70 歲組分別為0.23±0.04 和0.19±0.04，t＝0.75，P＝0.46）間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 血清外泌體miR-494-3p 篩查胃癌的ROC 曲線(xiàn)分析結(jié)果 以44 例胃癌患者作為疾病組，44 例健康人作為對(duì)照組，根據(jù)血清外泌體miR-494-3p的結(jié)果繪制ROC 曲線(xiàn)，血清外泌體miR-494-3p 篩查胃癌和健康人的ROC 曲線(xiàn)下面積（AUCROC）為0.725（95%CI：0.622～0.829，P＜0.01），最大約登指數(shù)為0.364，當(dāng)cut-off 值為0.370 時(shí)，敏感性為50.0%，特異性為86.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為63.3%，陰性預(yù)測(cè)值為78.6%，準(zhǔn)確性為68.2%，見(jiàn)圖1。

圖1 血清外泌體miR-494-3p 篩查胃癌和健康人的ROC 曲線(xiàn)

2.3 胃癌組和相關(guān)疾病對(duì)照組組織中miR-494-3p的表達(dá)水平比較 與相關(guān)疾病對(duì)照組組織中miR-494-3p的相對(duì)表達(dá)水平（1.00±0.39）相比，胃癌患者組織中miR-494-3p 的相對(duì)表達(dá)水平（0.22±0.07）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝2.66，P＜0.01）。

2.4 胃癌患者組織中miR-494-3p 表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌患者組織中miR-494-3p 的表達(dá)水平在不同性別、年齡、腫瘤浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤分期亞組中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 胃癌患者組織中miR-494-3p 表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

miR-494-3p 前體是位于14 號(hào)染色體上的miR-494，miR-494-3p 在多種腫瘤中異常表達(dá)，但在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同，通過(guò)相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制發(fā)揮癌基因［3，8］或者抑癌基因［4］作用，也可參與調(diào)控腫瘤耐藥［6］。早在2014 年有文獻(xiàn)［7］報(bào)道，miR-494在胃癌中通過(guò)靶向c-myc 發(fā)揮抑癌基因作用，在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平降低，且與不良預(yù)后相關(guān)；該作者通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miR-494 對(duì)胃癌具有抑制作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)［5］也表明miR-494 在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-494 可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，相較于胃良性疾病組織，胃癌組織中miR-494-3p 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），這與上述文獻(xiàn)［5，7］報(bào)道的其前體miR-494在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平降低的結(jié)論相符。另?yè)?jù)一項(xiàng)肺癌的研究［8］表明，組織中前體miR-494 的表達(dá)水平與成熟體miR-494-3p 水平存在直接相關(guān)性，故而在一定程度上證實(shí)miR-494-3p 在胃癌中也可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。然而，本研究結(jié)果顯示胃癌患者組織中miR-494-3p 的表達(dá)水平在不同腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移亞組中未見(jiàn)顯著差異，這與文獻(xiàn)［7］中發(fā)現(xiàn)miR-494存在顯著差異的結(jié)果不符，分析原因可能與本研究納入的胃癌組織樣本數(shù)較少導(dǎo)致亞組分析代表性不強(qiáng)有關(guān)，后續(xù)有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤患者miR-494-3p的表達(dá)水平與對(duì)應(yīng)的circRNA 呈負(fù)相關(guān)，miR-494-3p 表達(dá)水平降低可能與其作為環(huán)狀RNA 的靶點(diǎn)而發(fā)揮海綿作用有關(guān)，例如Circ_0007142 通過(guò)海綿miR-494-3p參與調(diào)節(jié)食管癌的耐藥［6］，Circ_0000745 還可通過(guò)海綿miR-494-3p 調(diào)控miR-494-3p／NET1 軸，促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病的進(jìn)展［9］。本研究尚未進(jìn)行胃癌中miR-494-3p 功能機(jī)制的研究，后續(xù)有待進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清外泌體中miR-494-3p的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于健康人對(duì)照組（P＜0.05），這與本研究胃癌組織中miR-494-3p 的表達(dá)水平降低一致，且與文獻(xiàn)報(bào)道胃癌患者血漿miR-494水平降低［9］及胃癌組織和細(xì)胞中miR-494表達(dá)降低［5，7］相符。上述結(jié)果表明，胃癌患者血清外泌體中miR-494-3p 水平可以反映其在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)水平，這為應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)胃癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。血清外泌體可能來(lái)源于腫瘤組織親本細(xì)胞的釋放，且在外泌體脂質(zhì)膜的富集和保護(hù)下，外泌體中miRNAs 信息在一定程度上能反映腫瘤組織的生物學(xué)信息，比血清或者血漿游離miRNAs 在液體活檢中發(fā)揮腫瘤標(biāo)志物作用方面更有意義。本研究中血清外泌體miR-494-3p區(qū)分胃癌患者和健康人的ROC 曲線(xiàn)下面積為0.725（95%CI：0.622～0.829，P＜0.01），當(dāng)cut-off 值為0.370 時(shí)，敏感性為50.0%，特異性為86.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為63.3%，陰性預(yù)測(cè)值為78.6%，準(zhǔn)確性為68.2%，說(shuō)明血清外泌體miR-494-3p 對(duì)胃癌具有一定的篩查價(jià)值。本研究數(shù)據(jù)表明該指標(biāo)特異性尚可，但敏感性不高，故不宜單獨(dú)用于胃癌診斷，可結(jié)合傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物或影像學(xué)檢查等其他檢查指標(biāo)，作為未來(lái)潛在的胃癌篩查和輔助診斷生物學(xué)標(biāo)志物。