邵靜茹，曹丹，鄔彩紅，潘英芳，劉艷，朱傳福，聶向民（.山東省血液中心HLA 研究室，濟(jì)南 5004；.泰安市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，山東泰安 700）

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是指由各類化學(xué)藥物、傳統(tǒng)中草藥等所誘發(fā)的肝損傷，嚴(yán)重可致急性肝衰竭，甚至死亡［1］。中藥何首烏（polygonum multiflorum thunb，PM）在臨床治療和保健用品中廣泛使用，但近年來有關(guān)何首烏致肝毒性的病例在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道［2-3］。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究結(jié)果顯示HLA基因與何首烏治療具有相關(guān)性，例如Li 等［4］報(bào)道了HLA-B*35：01 等位基因是引起PM-DILI 的危險(xiǎn)因素，可以作為預(yù)測(cè)PM-DILI 的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。2021年，黃德良等［5］進(jìn)一步驗(yàn)證了HLA-B*35：01 等位基因可能是何首烏導(dǎo)致藥物性肝損傷的分子標(biāo)志物。因此，我國(guó)發(fā)布的《何首烏安全用藥指南》［6］在何首烏肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)防控與建議中提出，對(duì)于攜帶HLA-B*35：01 等位基因生物學(xué)標(biāo)志物的患者，建議避免使用何首烏。

本研究對(duì)山東省各地市造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)的漢族志愿者HLA-B*35：01 等位基因的攜帶率和基因頻率進(jìn)行分布調(diào)查，同時(shí)通過文獻(xiàn)和資料檢索了中國(guó)部分省市漢族人群中HLA-B*35：01 等位基因的分布，了解作為何首烏肝損傷分子標(biāo)志物的HLA-B*35：01 等位基因在中國(guó)漢族人群中的分布情況和地區(qū)差異，以期為在使用何首烏治療相應(yīng)疾病前，是否需要進(jìn)行基因篩查以免發(fā)生不良后果及安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 山東人群數(shù)據(jù)檢索與提取 收集山東省骨髓庫2007 至2021 年入庫且具有HLA-B 位點(diǎn)高分辨數(shù)據(jù)的志愿者22 661 人作為研究對(duì)象，志愿者入庫年齡為18～45 歲，其中男12 808 例，女9 853 例，符合造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者健康征詢要求，均為漢族且無親緣關(guān)系，根據(jù)知情同意原則，均簽訂《中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫志愿捐獻(xiàn)者同意書》。采集靜脈血5 mL 于EDTA-K2抗凝管中，按照EZBeadTM全血DNA 提取試劑盒（批號(hào)：M314032，美國(guó)TBG 公司）及EZBead DNA 提取工作站（美國(guó)TBG 公司）說明書進(jìn)行全血基因組DNA 提取，樣本置于-20 ℃保存。

取200 μL DNA 標(biāo)本，采用PCR-序列特異的寡核苷酸探針雜交（sequence specific oligo-nucleotide probe，SSOP）法，使用LABTypeSSO 試劑盒（B位點(diǎn)批號(hào)：X1BR001，美國(guó)One Lambda 公司）及ABI 9700 型PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI 公司）對(duì)DNA標(biāo)本HLA-B 位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：96 ℃3 min；96 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，5 個(gè)循環(huán)；96 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Luminex100 型流式雜交儀（美國(guó)Luminex 公司）雜交和熒光標(biāo)記后，采用FLEXMAP-3D 多功能流式點(diǎn)陣儀（美國(guó)Luminex 公司）進(jìn)行HLA-B 高分辨等位基因分型，結(jié)果由HLA Fusion 軟件（美國(guó)One Lambda公司）根據(jù)陽性反應(yīng)探針自動(dòng)判讀。試驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說明書進(jìn)行。

HLA-B 位點(diǎn)數(shù)據(jù)以*后4 位為準(zhǔn)。按照中華骨髓庫志愿者所在地區(qū)進(jìn)行分組，得到濟(jì)南、菏澤、德州、濰坊、濟(jì)寧、泰安、臨沂、東營(yíng)、濱州、棗莊、日照、萊蕪、聊城等13 個(gè)組。

1.2 我國(guó)其他省市HLA-B*35：01 等位基因的數(shù)據(jù)檢索 使用檢索式（HLA）and（high-resolution or frequencies）and（allele or haplotype）and（Chinese or China）在PubMed 數(shù)據(jù)庫中檢索英文文獻(xiàn)，使用檢索式“HLA”and“高分辨”and“等位基因”在中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索中文文獻(xiàn)，并結(jié)合HLA 頻率數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.allelefrequencies.net）檢索中國(guó)其他各省市漢族人群HLA-B*35：01 等位基因分布的數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Micosoft excel 2010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，HLA-B*35：01 等位基因攜帶率＝攜帶標(biāo)本數(shù)／標(biāo)本總數(shù)×100%；HLA-B*35：01 等位基因頻率＝等位基因數(shù)／（2×標(biāo)本總數(shù)）×100%，分析方法為一般頻數(shù)分布。采用Micosoft excel 2010軟件對(duì)HLA-B*35：01 等位基因進(jìn)行哈溫（HWE）平衡計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 山東人群HLA-B*35：01 等位基因的攜帶率、基因頻率及哈溫平衡檢測(cè)結(jié)果 納入本次研究的山東漢族人群中，具有HLA-B 位點(diǎn)高分辨數(shù)據(jù)的樣本為22 661 例，其中攜帶HLA-B*35：01 基因者1 360例，純合攜帶者16 例，其等位基因攜帶率為6.0%；等位基因頻率為3.0%。HLA-B*35：01 等位基因攜帶率最高的2 個(gè)城市分別為濱州（6.68%）和聊城（6.65%），等位攜帶率最低的2 個(gè)城市分別為棗莊（3.76%）和日照（4.67%）。哈溫平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，HLA-B*35：01 等位基因在山東各個(gè)地區(qū)中的分布符合哈溫平衡（P＞0.05），見表1。

表1 山東地區(qū)漢族人群HLA-B*35：01 等位基因攜帶率和等位基因頻率

2.2 中國(guó)其他省市漢族人群HLA-B*35：01 等位基因攜帶率及基因頻率 檢索中國(guó)其他省市漢族人群的文獻(xiàn)，如有多篇報(bào)道同一地區(qū)的文獻(xiàn)，以樣本量多的文獻(xiàn)為參考數(shù)據(jù)，納入研究中國(guó)部分省市中，上海、云南、湖北、浙江、重慶、江蘇、廣州、南寧、中國(guó)香港和中國(guó)臺(tái)灣歸類于中國(guó)南方地區(qū)，河南、陜西、遼寧、安徽、京津冀地區(qū)、黑龍江歸類于中國(guó)北方地區(qū)，其HLA-B*35：01 等位基因攜帶率和等位基因頻率數(shù)據(jù)見表2。

表2 中國(guó)其他省市漢族人群HLA-B*35：01 等位基因攜帶率和等位基因頻率

3 討論

PM-DILI 是一種不可預(yù)測(cè)的、與劑量無關(guān)的遲發(fā)性藥物不良反應(yīng)［22-23］，這種遲發(fā)性藥物不良反應(yīng)可能是由T 細(xì)胞的不適當(dāng)激活引起的。HLA 分子被認(rèn)為是主要激活T 細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白［24-25］，因此，HLA基因多態(tài)性可能是導(dǎo)致DILI 的高風(fēng)險(xiǎn)因素［26-27］。Li 等［4］通過研究將HLA-B*35：01 確定為PM-DILI 的潛在遺傳高危因素，揭示了HLA-B*35：01作為一種生物學(xué)標(biāo)志物可能具有潛在的臨床價(jià)值。黃德良等［5］研究發(fā)現(xiàn)，所有確診何首烏導(dǎo)致藥物性肝損傷的患者均攜帶HLA-B*35：01 等位基因，進(jìn)一步證實(shí)何首烏誘導(dǎo)肝損傷與HLA-B*35：01 等位基因存在相關(guān)性。

本研究中，納入研究的山東地區(qū)漢族人群中攜帶HLA-B*35：01 等位基因的有1 360 例，其等位基因攜帶率為6.0%，等位基因頻率為3.0%。此外，泰安（6.64%）、萊蕪（6.27%）、臨沂（6.06%）和濟(jì)南（6.57%）的攜帶率均超過了全?。?%）平均值。中國(guó)常見及確認(rèn)的HLA 等位基因表（Common alleles and well documented alleles，CWD）（2.3 版）顯示，在中國(guó)人群中，HLA-B*35：01 的等位基因頻率為2.47%，等位基因攜帶率約為4.9%。相比之下，山東漢族人群HLA-B*35：01 的等位基因頻率高于全國(guó)平均比例，攜帶率較低的日照也達(dá)到了4.67%，接近全國(guó)4.9%的均值。Allele*Frequencies數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.allelefrequencies.net／hla.asp）和文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)顯示，HLA-B*35：01 等位基因在湖北漢族［14］、江蘇漢族［18］、浙江漢族［16］、安徽漢族［10］、廣西南寧漢族［21］、重慶漢族［17］、上海漢族［11］、廣州漢族［20］、云南漢族［12］以及中國(guó)香港［19］和中國(guó)臺(tái)灣［15］等南方人群的攜帶率分別約為5.12%、4.72%、4.88%、6.2%、1.42%、4.74%、6%、2.96%、6%、3.76%和4.96%，而河南漢族［7］、遼寧漢族［16］、黑龍江漢族［13］、陜西漢族［8］和京津冀地區(qū)等北方人群的攜帶率分別為7.3%、6.64%、5.4%、7.34%和6%。南方人群中除湖北、上海、云南和安徽人群外，其余均低于或接近于全國(guó)平均4.9%的攜帶率，而北方人群中均高于全國(guó)4.9%的均值?？梢钥闯鯤LA-B*35：01 等位基因在北方的分布高于南方，提示中國(guó)人群HLA基因分布具有明顯的地域性。

從以上數(shù)據(jù)來看，為了避免藥物性肝損傷的發(fā)生，中國(guó)北方人群對(duì)在使用何首烏及其相關(guān)制劑時(shí)開展HLA-B*35：01 等位基因篩查的迫切性高于南方人群。本研究中對(duì)山東地區(qū)漢族人群進(jìn)行了較為細(xì)致的劃分，發(fā)現(xiàn)省內(nèi)不同地市之間也存在頻率分布的差異，濟(jì)南、泰安、聊城、濱州等地HLA-B*35：01等位基因攜帶率較高，可以嘗試性開展用藥前基因篩查。

本研究通過對(duì)PM-DILI 分子標(biāo)志物HLA-B*35：01等位基因在中國(guó)部分省市漢族人群中進(jìn)行分布調(diào)查，揭示了該等位基因在中國(guó)不同地區(qū)的分布特點(diǎn)，能夠了解不同地區(qū)人群的基因分布特征，為在使用何首烏之前是否進(jìn)行HLA 基因分型篩查提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，對(duì)于避免PM-DILI 的發(fā)生，倡導(dǎo)安全用藥有著重要的影響與意義。地處經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)、醫(yī)療條件良好地區(qū)，特別是所在省份的省會(huì)城市，可以嘗試性的在一定范圍內(nèi)進(jìn)行用藥前的基因篩查，結(jié)合臨床病例分析，為是否適合大范圍推廣篩查提供可靠的臨床數(shù)據(jù)。本研究尚存在諸多不足之處，例如因數(shù)據(jù)庫檢索權(quán)限和使用的限制，加之文獻(xiàn)數(shù)據(jù)并沒有概括所有人群，本研究并未包括中國(guó)全部地區(qū)和民族的人群數(shù)據(jù)，無法作出更為全面細(xì)致的分析。此外，對(duì)于專門針對(duì)HLA-B*35：01基因檢測(cè)試劑盒的研發(fā)以及開展基因檢測(cè)的成本效益分析也將是筆者后期需進(jìn)行的研究?jī)?nèi)容，為臨床檢測(cè)降低檢測(cè)成本和精準(zhǔn)用藥提供更為科學(xué)準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。