劉義，黃麗紅，李想，王鳳，王禹，喬永超（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院.檢驗科，.老年病科，廣西桂林 541004）

2 型糖尿病（T2DM）是一種多基因遺傳的進(jìn)行性代謝疾病，其發(fā)生及演變與環(huán)境和遺傳因素密切相關(guān)［1］。目前，臨床上已對T2DM 的遺傳易感性進(jìn)行了大量研究，其中，脂聯(lián)素基因（ADIPOQ）不同位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）與T2DM 及其代謝參數(shù)間的關(guān)系在不同人群中被廣泛報道［2-4］，然而，上述文獻(xiàn)結(jié)果存在明顯的不一致性。

一項薈萃分析結(jié)果表明，ADIPOQ基因rs2241766 SNP 與歐洲和東亞人群T2DM 不相關(guān)，并且對南亞和西亞人群的T2DM 影響結(jié)果呈現(xiàn)相反性［5］，其TG、TT 和TT+TG 基因型增加了西亞人群的T2DM 風(fēng)險（P分別為0.02，0.01，0.01；OR分別為2.22，2.29，2.28；95%CI：1.14～1.32，1.21～4.34，1.21～4.28），但卻降低了南亞人群的T2DM 風(fēng)險（P分別為0.009，0.005，0.004；OR分別為0.54，0.53，0.53；95%CI：0.34～0.86，0.34～0.83，0.34～0.82）。這使得rs2241766 SNP 對T2DM 易感性的影響存在爭議，上述SNP 的分布差異可能與人群、種族和地區(qū)相關(guān)，分布不同對T2DM 易感性的影響也不同。本研究旨在探討廣西壯族人群rs2241766 SNP 與T2DM 易感性及其多種代謝指標(biāo)之間的潛在相關(guān)性，以期為T2DM 的早期預(yù)防、診斷、治療及群體遺傳學(xué)研究等提供實驗依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 招募2021 年9 月至2022 年1 月于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的212 例T2DM 患者作為T2DM 組，其中男117 例，女95 例，年齡39.0～56.8 歲，中位年齡49.0 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：T2DM 患者均遵循2020 年美國糖尿病協(xié)會的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；均無相關(guān)藥物治療史（如二甲雙胍、磺酰脲類、吡格列酮及胰島素等用藥）；均未合并重大并發(fā)癥（如腎病、腦卒中、視網(wǎng)膜病變等）；均無糖尿病家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除T2DM 外的其他類型糖尿?。ㄈ? 型糖尿病和妊娠性糖尿病等）；均排除肝、腎、肺、心腦血管、自身免疫、重度感染、惡性腫瘤等重大疾?。慌懦哂兄卮笸鈧敖谑中g(shù)史的患者。納入同期在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心體檢的289 例健康志愿者作為健康人對照組，其中男116例，女173 例，年齡35.0～48.0 歲，中位年齡42.0歲。各研究對象均屬于獨(dú)立的廣西壯族個體，個體間均無親緣關(guān)系。本研究方案獲得桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：QTLL202123），各研究對象均知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 QT-1 漩渦混合器（上海琪特分析儀器公司），TD5A-WS 臺式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器公司），DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備公司），F(xiàn)R-110 紫外分析裝置、FR-250 電泳儀（上海復(fù)日科技公司），多用途水平電泳槽（北京百晶生物科技公司），2720 Thermal Cycler 擴(kuò)增儀、3130xl genetic analyze 分析儀（美國ABI 公司），Cabas8000 全自動生化免疫分析儀（上海羅氏診斷產(chǎn)品公司），Autolumo A2000 Plus 全自動化學(xué)發(fā)光測定儀（鄭州安圖實驗儀器公司）。DNA 全血提取試劑盒（北京天根生化科技公司），SNPscanTM分型試劑盒、Tag DNA 連接酶（50 U／μL）、Tag DNA 連接緩沖液購自上海天昊生物科技公司，10×PCR 緩沖液、dNTP mix（2.5 mmol／L）、TaKaRa HotStart Taq DNA 耐熱聚合酶（5 U／μL）購自日本TaKaRa 公司，Hi-Di 甲酰胺、GeneScanTM-600 染料購自美國ABI 公司，MgCl2（25 mmol／L）購自上海生工公司，葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶法）、尿素／尿素氮檢測試劑盒（比色法）、肌酐檢測試劑盒（苦味酸法）、三酰甘油檢測試劑盒（比色法）、膽固醇檢測試劑盒（酶比色法）、高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒（酶比色法）、低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒（直接法）及C 反應(yīng)蛋白檢測試劑盒（免疫比濁法）均購自上海羅氏診斷產(chǎn)品公司，促腎上腺皮質(zhì)激素檢測試劑盒、血管緊張素2 檢測試劑盒、醛固酮檢測試劑盒、腎素檢測試劑盒、人生長激素檢測試劑盒、胰島素樣生長因子1 檢測試劑盒、人皮質(zhì)醇檢測試劑盒（均為磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）購自鄭州安圖生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及臨床生化指標(biāo)測定 采集各研究對象體檢或就診時的空腹靜脈血3～5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，3 000 r／min 離心5 min，分離血漿和白膜層血液，置于2.5 mL EP 管中。嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說明書操作檢測血漿標(biāo)本的各項臨床生化指標(biāo)，包括：空腹血糖（FPG）、尿素（Urea）、肌酐（Cr）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、血管緊張素2（AⅡ）、醛固酮（ALD）、腎素（REN）、生長激素（GH）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）及皮質(zhì)醇（Cor）。各指標(biāo)的參考區(qū)間：FPG：3.9～6.1 mmol／L；Urea：2.14～7.14 mmol／L；Cr：男性62～106 μmol／L，女 性44～80 μmol／L；TG：＜2.26 mmol／L；TC：＜5.2 mmol／L；HDL-C：1.16～1.55 mmol／L；LDL-C：＜3.37 mmol／L；CRP：＜5 mg／L；ACTH：7.2～63.4 pg／mL；A Ⅱ：25～129 pg／mL（臥位）；ALD：40～310 pg／mL（站位）；REN：4～38 pg／mL（站位）；GH：男性＜0.02 ng／mL，女性0.024～5.419 ng／mL；Cor：4.26～24.85 pg／dL。

1.3.2 DNA 樣本制備及濃度、純度鑒定 取200 μL白膜層血液樣本，按照人類基因組DNA 全血提取試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA 提取。取1 μL DNA 樣本通過紫外分光光度儀檢測其吸光度（A260nm／A280nm）值，選取比值為1.7～2.0，濃度30～50 ng／μL，總量大于600 ng 的DNA 樣本置于-80 ℃儲存。

1.3.3 引物設(shè)計與合成 利用NCBI 在線數(shù)據(jù)庫查詢ADIPOQ基因rs2241766 位點(diǎn)的堿基序列，引物片段大小305 bp。采用Primer Premier 3.0 軟件設(shè)計引物，并委托上海天昊生物科技公司進(jìn)行引物合成。上游引物序列：5＇-TGAGTCGTGGTTTCCTGG TCAGGA-3＇，長度24 bp；下游引物序列：5＇-TTTGA GTCGTGGTTTCCTGGTCAGGC-3＇，長度26 bp。退火溫度58～62 ℃，產(chǎn)物片段大小80～150 bp。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增及分型檢測 樣本裂解總體積為10 μL，包括：30～50 ng／μL DNA 樣本4 μL，2.5 μL 4×DNA 連接緩沖液，3.5 μL ddH2O。樣本裂解參數(shù)：98 ℃裂解5 min 后立即冰置。連接反應(yīng)總體積為20 μL，包括：10 μL 裂解DNA 樣本，2 μL 10×DNA 連接緩沖液，50 U／μL DNA 連接酶0.5 μL，1 μL連接探針混合物，6.5 μL ddH2O。連接反應(yīng)參數(shù)：94 ℃1 min，58 ℃4 h，循環(huán)4 次；94 ℃2 min，72 ℃保存連接產(chǎn)物。多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)總體積為20 μL，包括：10 μL 2×PCR 混合物，1 μL 多重引物混合物Ⅰ／Ⅱ，1 μL 連接產(chǎn)物，8 μL ddH2O。多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃2 min；94 ℃20 s，62 ℃40 s（每個循環(huán)-0.5 ℃），72 ℃1.5 min，循環(huán)9 次；94 ℃20 s，57 ℃40 s，72 ℃1.5 min，循環(huán)25 次；68 ℃1 h，4 ℃保存產(chǎn)物。取1 μL 稀釋10 倍的PCR 產(chǎn)物、0.5 μL Liz600 分子量內(nèi)標(biāo)與8.5 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min 后用ABI 3730XL 測序儀進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳分離，最終通過Gene-Mapper 4.1軟件根據(jù)產(chǎn)物應(yīng)有的位置是否出現(xiàn)檢測峰判斷是否有對應(yīng)的等位基因，從而確定分型結(jié)果，各基因型包括：GG（單峰）、TG（雙峰）和TT（單峰）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以樣本量100 為界限進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov 或Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料均以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，兩組以上比較采用One way ANOVA 檢驗；非正態(tài)分布的計量資料均以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，兩組以上比較采用Kruskal-WallisH檢驗。組間計數(shù)資料比較及Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律采用χ2檢驗；采用二元Logistic回歸進(jìn)行基因多態(tài)性遺傳風(fēng)險分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廣西壯族T2DM 患者與健康人群rs2241766T／G 多態(tài)性的比較ADIPOQ基因rs2241766T／G 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布如下：T2DM 患者：GG（5.7%）、TG（44.3%）、TT（50.0%），G（27.8%）和 T（72.2%）；健康對照人群：GG（11.8%）、TG（37.7%）、TT（50.5%），G（30.6%）和T（69.4%）?；蛐皖l率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（T2DM 組：χ2＝2.57，P＝0.28；健康人對照組：χ2＝4.62，P＝0.1），表明所選研究對象的ADIPOQrs2241766T／G 基因型分布具有良好的群體代表性。T2DM 組與健康人對照組間基因型頻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6.294，P＝0.043）；兩組間等位基因頻率相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.918，P＝0.338）。見表1。

表1 廣西壯族T2DM 患者及健康人群ADIPOQ 基因rs2241766 SNP 的頻率分布及風(fēng)險評估

2.2 廣西壯族 T2DM 患者ADIPOQ基因rs2241766T／G 多態(tài)性的風(fēng)險評估 Logistic 回歸結(jié)果顯示，相比于GG 基因型，TG（OR＝2.443，95%CI：1.197～4.988，P＝0.014）、TT（OR＝2.057，95%CI：1.017～4.159，P＝0.045）及TG+TT（OR＝2.222，95%CI：1.122～4.402，P＝0.022）基因型與T2DM 風(fēng)險增加顯著相關(guān)。在調(diào)整性別和年齡共同混雜因素后，此相關(guān)性仍持續(xù)存在，rs2241766T／G 的TG、TT 及TG+TT 基因型患T2DM 風(fēng)險分別是GG 基因型的2.863 倍（OR＝2.863，95%CI：1.352～6.060，P＝0.006）、2.291 倍（OR＝2.291，95%CI：1.094～4.800，P＝0.028）和2.532 倍（OR＝2.532，95%CI：1.235～5.192，P＝0.011）。見表1。

2.3 廣西壯族T2DM 患者與健康對照人群的一般臨床資料比較 如表2 分析結(jié)果顯示，相比于健康人對照組，T2DM 組的男性頻率、中位年齡及血漿FPD、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平升高，而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；血漿Cr、TC、LDL-C 水平在T2DM 組中雖呈升高趨勢，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

表2 廣西壯族T2DM 患者和健康對照人群的一般臨床資料比較

2.4 廣西壯族人群同種rs2241766T／G 基因型的代謝指標(biāo)比較 相比于健康人對照組GG 基因型，T2DM 組GG 基因型的FPG、AⅡ、REN、GH、Cor 水平升高，ACTH、ALD、IGF-1 水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。FPG、Urea、TG、TC、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平在兩組TG 型間的差異仍具統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），且在T2DM 組呈現(xiàn)高水平狀態(tài)；而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 則呈低水平趨勢（P均＜0.05）。T2DM 組TT 型的FPG、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平明顯高于健康人對照組，但其HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平則相反（P均＜0.05）。見表3～5。

表3 T2DM 患者與健康對照人群GG 基因型的臨床代謝指標(biāo)比較

表4 T2DM 患者與健康對照人群TG 基因型的臨床代謝指標(biāo)比較

表5 T2DM 患者與健康對照人群TT 基因型的臨床代謝指標(biāo)比較

2.5ADIPOQrs2241766T／G 多態(tài)性對T2DM 代謝指標(biāo)的影響 T2DM 患者的FPG、Urea、TG、TC、HDL-C、LDL-C、CRP、ACTH、AⅡ、ALD、REN、GH、IGF-1、Cor 水平均不受rs2241766T／G SNP 顯著影響，各基因型間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），但三組不同基因型患者的Cr 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.049），rs2241766T／G SNP 可影響廣西壯族T2DM 患者的Cr 代謝水平。見表6。

表6 不同rs2241766T／G 基因型T2DM 患者的臨床代謝指標(biāo)比較

3 討論

T2DM 是一種常見的慢性進(jìn)行性代謝疾病，常導(dǎo)致機(jī)體各種代謝參數(shù)出現(xiàn)異常［7-9］。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM 患者的FPD、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平高于健康對照人群；而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平低于健康人對照人群，符合T2DM的代謝特征［10］。

ADIPOQ作為糖尿病腎病候選基因［11］，被證實與代謝綜合征及T2DM 易感性相關(guān)［4，12-14］。其中，rs2241766 SNP 在不同人群中被廣泛報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TG、TT 基因型及TG+TT 基因型均與T2DM 易感性增加顯著相關(guān)。在調(diào)整性別和年齡共同風(fēng)險因素后，此相關(guān)性仍顯著；TG、TT、TG+TT基因型患T2DM 的風(fēng)險分別是GG 基因型的2.863、2.291 和2.532 倍，表 明rs2241766G／T SNP 為T2DM 風(fēng)險因素，且TG 和TT 基因型可能是T2DM易感基因型，而GG 基因型可能對其有保護(hù)作用。此相關(guān)性與以往不同人群中的研究結(jié)果呈現(xiàn)一致性［3，15-17］，但仍與部分報道結(jié)果相悖，例如Han等［18］研究表明此多態(tài)性與T2DM 不相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，無論是T 等位基因還是G 等位基因均與廣西壯族人群T2DM 風(fēng)險不相關(guān)，不構(gòu)成其易感因素。但近期針對中國臺灣人群的研究表明，攜帶G等位基因的中國臺灣個體發(fā)生T2DM 風(fēng)險比攜帶T等位基因人群高0.82 倍［2］；Dong 等［5］的一項薈萃分析結(jié)果表明，rs2241766 T 等位基因增加了西亞人群T2DM 風(fēng)險，而相同等位基因卻降低了南亞人群的T2DM 風(fēng)險。綜上所述，地區(qū)差異、人群不同及群體遺傳多樣性可能是造成上述結(jié)果差異的潛在原因。本研究針對的是廣西壯族人群，雖與中國臺灣人群同屬中國個體，但極大可能存在種族遺傳差異性，導(dǎo)致所得結(jié)果相矛盾。T2DM 的發(fā)生本是一個復(fù)雜的過程，受不同基因、不同SNP 及環(huán)境因素等共同影響，本研究中調(diào)整因素較少，其他外源混雜因素可能對研究結(jié)果有潛在影響。以往報道rs2241766G／T SNP 與糖尿病多種代謝參數(shù)相關(guān)［19-21］，但本研究僅發(fā)現(xiàn)Cr 水平受此多態(tài)性影響，并且影響結(jié)果位于統(tǒng)計學(xué)臨界值（P＝0.049），分析原因可能本研究樣本量有限和樣本選擇偏倚降低了研究結(jié)果的權(quán)威性，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，排除更多混雜因素進(jìn)行更精確分析。

本研究評估ADIPOQrs2241766G／T SNP 與廣西壯族T2DM 易感性間的相關(guān)性，豐富了ADIPOQSNPs 在人類群體遺傳學(xué)方面的研究。但本研究仍存在局限之處，包括研究對象來源單一、未排除基因—環(huán)境相互作用的影響、樣本量不足及排除混雜因素少等。后續(xù)的ADIPOQSNP 研究將進(jìn)一步加大樣本量及擴(kuò)寬研究對象納入范圍。綜上所述，ADIPOQrs2241766G／T 多態(tài)性與廣西壯族T2DM易感性增加顯著相關(guān)，可能是預(yù)測T2DM 風(fēng)險的潛在遺傳標(biāo)志物；對攜帶TG 和TT 基因型的個體進(jìn)行早期干預(yù)可能是預(yù)防和延緩T2DM 發(fā)生和進(jìn)展的有效手段。