臧云曉 彭榮梅 肖格格 何林輝 洪晶

北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科 眼部神經(jīng)損傷的重建保護(hù)與康復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191

目前已知感染角膜組織的病毒多為皰疹病毒,包括1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)、水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)和EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV),上述皰疹病毒可以分布于角膜任何層次,造成不同層次的角膜感染[1]。在既往研究中,HSV-1相關(guān)的角膜感染多見(jiàn)于角膜上皮層和基質(zhì)層。有研究顯示,在357例新發(fā)HSV角膜炎中,角膜上皮炎和基質(zhì)炎分別占66%和30%[2]。HSV角膜內(nèi)皮炎未見(jiàn)流行病學(xué)報(bào)道;VZV可以感染角膜各個(gè)層次,但常見(jiàn)于角膜基質(zhì)炎和內(nèi)皮炎[3-4];CMV主要造成角膜內(nèi)皮炎[5],在亞洲人群中常見(jiàn),日本一項(xiàng)研究顯示,在29例病因未明的角膜內(nèi)皮炎中,CMV DNA陽(yáng)性率為24%[6]。CMV角膜上皮炎和基質(zhì)炎僅有少量病例報(bào)道[7-8];目前對(duì)EBV角膜感染知之甚少,僅在干燥性角結(jié)膜炎患者的淚液、角膜基質(zhì)炎和角膜內(nèi)皮炎的房水中檢測(cè)到EBV DNA存在[5,9-10]。本課題組前期研究顯示,在連續(xù)收集的44例病毒性角膜內(nèi)皮炎患者中,CMV、HSV、VZV和EBV的占比分別為45%(20/44)、18%(8/44)、23%(10/44)和14%(6/44)[4]。當(dāng)前,皰疹病毒性角膜炎的診斷主要依據(jù)臨床癥狀和體征,例如HSV角膜上皮炎在特殊時(shí)期存在典型的樹(shù)枝狀或地圖狀角膜上皮缺損;VZV角膜基質(zhì)炎表現(xiàn)為對(duì)應(yīng)部位的基質(zhì)混濁,通常發(fā)生在皮疹痊愈后;大多數(shù)CMV角膜內(nèi)皮炎可見(jiàn)錢(qián)幣狀角膜后沉著物、局限性角膜水腫以及輕度前葡萄膜炎[11]。然而,一些不被人們熟知的皰疹病毒性角膜炎,如HSV角膜內(nèi)皮炎、CMV角膜基質(zhì)炎等往往無(wú)法通過(guò)臨床特征診斷。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年來(lái)廣泛應(yīng)用于眼部皰疹病毒感染的一種檢測(cè)方法,該方法可以幫助診斷之前無(wú)法確診病原體的病毒性角膜炎[12-13]。病毒DNA PCR檢測(cè)可以幫助確定皰疹病毒種類(lèi)[14],從而明確診斷和調(diào)整用藥。在皰疹病毒角膜炎的病毒DNA檢測(cè)中,角膜和房水是2種常用的取材檢測(cè)樣本,在角膜移植患者中非常容易獲取[13]。然而,對(duì)于非角膜移植患者,角膜通常難以獲取,房水也需要進(jìn)行前房穿刺才能獲得,因其為有創(chuàng)操作,增加了眼部感染和出血的風(fēng)險(xiǎn),很多患者不愿接受,因此經(jīng)驗(yàn)性診治仍然是目前的臨床現(xiàn)狀。然而,經(jīng)驗(yàn)性治療使得在抗病毒藥物的選擇上存在困難,往往貽誤最佳治療時(shí)機(jī)。本研究選取皰疹病毒DNA陽(yáng)性的角膜移植患者,通過(guò)分析皰疹病毒DNA在角膜層次中的分布,比較角膜和房水樣本在該人群中的病毒DNA檢測(cè)效率,旨在提高臨床皰疹病毒DNA的檢出率,明確皰疹病毒性角膜炎的分類(lèi)診斷,盡早開(kāi)展合理治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用診斷試驗(yàn)研究方法,收集2015年5月至2021年8月在北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科行角膜移植手術(shù)且術(shù)中行房水和/或角膜組織病毒學(xué)檢測(cè)的患者資料。納入患者至少有1種樣本病毒檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。病毒檢測(cè)包括CMV、VZV、HSV-1、HSV-2和EBV。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)既往或目前存在角膜炎癥反應(yīng);(2)存在相應(yīng)部位角膜病變;(3)符合不同皰疹病毒角膜感染的臨床癥狀和體征;(4)房水和/或角膜組織的病毒檢測(cè)陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)2種或2種以上皰疹病毒陽(yáng)性的患者;(2)由于臨床證據(jù)不足無(wú)法判斷角膜病變層次的患者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào):M2021283),入組患者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1資料收集和分析指標(biāo) 通過(guò)北京大學(xué)第三醫(yī)院臨床病歷系統(tǒng)收集皰疹病毒DNA陽(yáng)性患者的一般資料,包括性別、年齡、皰疹病毒類(lèi)別和病變層次。分析皰疹病毒DNA在角膜的分布層次和比例。樣本檢測(cè)種類(lèi)包括角膜和房水。病變層次依據(jù)手術(shù)方式和輔助檢查結(jié)果進(jìn)行判斷。病變層次分為角膜內(nèi)皮層和基質(zhì)層。因角膜基質(zhì)病變行前部板層角膜移植術(shù)(anterior lamellar keratoplasty,ALK)或穿透角膜移植術(shù)(penetrating keratoplasty,PKP)而術(shù)中觀察內(nèi)皮層正常者視為基質(zhì)層病變,因角膜水腫無(wú)基質(zhì)浸潤(rùn)和瘢痕而行角膜內(nèi)皮移植術(shù)(Descemet stripping automated endothelial keratoplasty,DSAEK)的患者視為內(nèi)皮層病變。

通過(guò)北京大學(xué)第三醫(yī)院臨床醫(yī)囑系統(tǒng)收集同時(shí)存在角膜和房水雙樣本病毒DNA檢測(cè)結(jié)果患者的臨床和樣本資料,分析不同種類(lèi)皰疹病毒在角膜和房水中病毒DNA檢測(cè)的樣本數(shù)和比率,通過(guò)受試者工作特征曲線(xiàn)(receiver operating characteristic curve,ROC)的曲線(xiàn)下面積(area under curve,AUC)評(píng)估不同皰疹病毒在角膜和房水中的病毒檢測(cè)效率,即靈敏度。

1.2.2樣本收集 角膜移植手術(shù)操作均由同一經(jīng)驗(yàn)豐富的眼科醫(yī)生完成,手術(shù)方式分為PKP、ALK和DSAEK。在角膜移植術(shù)中采集角膜和房水樣本。在鉆取角膜組織前,用1 ml注射器行前房穿刺抽取足量房水,然后處理患者病變角膜組織。術(shù)中刮除患者角膜上皮組織,取下的病變角膜若為板層組織,撕除角膜前部板層,留取角膜后部基質(zhì)層送檢;若為全層角膜,則分別撕取角膜內(nèi)皮層和基質(zhì)層,并分別送檢;若為內(nèi)皮層則直接送檢。

1.2.3PCR法檢測(cè)病毒種類(lèi) 取出的房水和角膜分別放入1.5 ml EP管中,送至北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明,使用QIAamp DNA微量試劑盒(德國(guó)Qiagen公司),從獲取的角膜或房水中提取DNA。將檢測(cè)樣品置于1.5 ml離心管中并用加有蛋白酶K的緩沖液ATL消化。將提取到的DNA在DEPC水(上海碧云天生物技術(shù)公司)中稀釋;DNA均定量50 ng進(jìn)行PCR。按照說(shuō)明,使用熒光定量PCR儀(美國(guó)PE Biosystems公司),通過(guò)基于TaqMan探針熒光定量PCR的方法(HSV-1、HSV-2 RT-PCR試劑盒,Z-SD-0136-02;VZV RT-PCR試劑盒,OD-0024-02;CMV RT-PCR試劑盒,Z-OD-002-02;EBV RT-PCR試劑盒,Z-OD-0023-02;上海之江生物科技股份有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。病毒DNA的檢測(cè)限度為每個(gè)樣品大小10個(gè)拷貝。每個(gè)樣品均添加內(nèi)部對(duì)照以評(píng)估分離和擴(kuò)增功效。試劑盒制造商提供陽(yáng)性、陰性和內(nèi)部對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 皰疹病毒DNA陽(yáng)性的病毒種類(lèi)

共納入角膜移植術(shù)中皰疹病毒DNA陽(yáng)性患者166例166眼,其中CMV DNA檢出率最高,陽(yáng)性75眼(占45.2%),男34眼,女41眼,平均年齡(40±29)歲;其次為HSV-1 DNA,陽(yáng)性34眼(占20.5%),男27眼,女7眼,平均年齡(59±21)歲;第3位為VZV DNA,陽(yáng)性30眼(占18.1%),男17眼,女13眼,平均年齡(45±26)歲;第4位為EBV DNA,陽(yáng)性27眼(占16.3%),男12眼,女15眼,平均年齡(46±29)歲;未檢測(cè)到HSV-2陽(yáng)性者。

2.2 皰疹病毒DNA在角膜的層次分布比較

CMV和VZV DNA在角膜內(nèi)皮層分布者分別為47眼(占62.7%)和26眼(占86.7%),明顯多于基質(zhì)層的28眼(占37.3%)和4眼(占13.3%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.813、16.133,均P<0.05)。HSV-1和EBV DNA在角膜內(nèi)皮層分布者分別為8眼(占23.5%)和5眼(占18.5%),分別少于基質(zhì)層的26眼(占76.5%)和22眼(占81.5%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.529、10.704,均P<0.001)(表1)。

表1 皰疹病毒DNA在角膜的檢出層次分布比較[眼數(shù)(%)]Table 1 Comparison of layer distribution of herpesvirus DNA detection in cornea [eyes (%)]病變層次總眼數(shù)CMV DNA陽(yáng)性VZV DNA陽(yáng)性HSV-1 DNA陽(yáng)性EBV DNA陽(yáng)性基質(zhì)層8028(37.3)4(13.3)26(76.5)22(81.5)內(nèi)皮層8647(62.7)26(86.7)8(23.5)5(18.5)χ2值4.81316.1339.52910.704P值<0.05<0.001<0.001<0.001 注:(χ2檢驗(yàn)) CMV:巨細(xì)胞病毒;VZV:水痘-帶狀皰疹病毒:HSV:單純皰疹病毒;EBV:EB病毒 Note:(χ2test) CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Ep-stein-Barr virus

2.3 皰疹病毒DNA在角膜和房水樣本中的檢測(cè)效率

在皰疹病毒DNA陽(yáng)性患者的166眼中,具有房水和角膜雙樣本病毒檢測(cè)結(jié)果者73眼,其中CMV、VZV、HSV-1、EBV DNA陽(yáng)性的樣本數(shù)分別為28、14、18和13眼。在73眼146例檢測(cè)樣本中,CMV、VZV、EBV角膜陽(yáng)性房水陰性、房水陽(yáng)性角膜陰性、角膜和房水均陽(yáng)性占比總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.143、6.143、11.231,均P<0.05)(表2)。皰疹病毒DNA陽(yáng)性樣本的檢測(cè)靈敏度結(jié)果顯示,角膜樣本的病毒PCR檢測(cè)總體靈敏度為71.6%,高于房水的54.1%,其中,CMV和VZV DNA陽(yáng)性的角膜樣本檢測(cè)靈敏度分別為64.3%(AUC=0.821,95%CI:0.705～0.938)和35.7%(AUC=0.679,95%CI:0.475～0.882),分別低于房水樣本的71.4%(AUC=0.875,95%CI:0.750～0.964)和85.7%(AUC=0.929,95%CI:0.816～1.000)。HSV-1和EBV DNA陽(yáng)性的角膜樣本檢測(cè)靈敏度分別為100%(AUC=1.000,95%CI:1.000～1.000)和92.3%(AUC=0.962,95%CI:0.875～1.000),明顯高于房水樣本的27.8%(AUC=0.639,95%CI:0.455～0.823)和23.1%(AUC=0.615,95%CI:0.395～0.835)(表3,圖1)。

表2 皰疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒檢測(cè)結(jié)果比較[眼數(shù)(%)]Table 2 Comparison of herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples [eyes (%)]類(lèi)別總眼數(shù)CMV DNA陽(yáng)性VZV DNA陽(yáng)性HSV-1 DNA陽(yáng)性EBV DNA陽(yáng)性角膜陽(yáng)性房水陰性33(44.6)8(28.6)2(14.3)13(72.2)10(77.0)房水陽(yáng)性角膜陰性20(27.0)10(35.7)9(64.3)0(0.0)1(7.7)角膜和房水均陽(yáng)性20(27.0)10(35.7)3(21.4)5(27.8)2(15.4)χ2值4.2435.1436.1433.55911.231P值0.1200.0230.0460.0590.004 注:(χ2檢驗(yàn)) CMV:巨細(xì)胞病毒;VZV:水痘-帶狀皰疹病毒:HSV:單純皰疹病毒;EBV:EB病毒 Note:(χ2 test) CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Ep-stein-Barr virus

表3 皰疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒檢測(cè)效率[例數(shù)(%)]Table 3 Efficiency of herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples [cases (%)]樣本類(lèi)別總例數(shù)CMV DNA陽(yáng)性VZV DNA陽(yáng)性HSV-1 DNA陽(yáng)性EBV DNA陽(yáng)性角膜組織PCR陽(yáng)性53(36.3)18(32.1)5(17.9)18(50.0)12(46.1)角膜組織PCR陰性20(13.7)10(17.9)9(32.1)0(0.0)1(3.8)AUC0.8580.8210.6791.0000.96295% CI0.793-0.9230.705-0.9380.475-0.8821.000-1.0000.875-1.000靈敏度71.6%64.3%35.7%100%92.3%房水樣本PCR陽(yáng)性40(27.4)20(35.7)12(42.9)5(13.9)3(11.5)房水樣本PCR陰性33(22.6)8(14.3)2(7.1)13(36.1)10(38.5)AUC0.7700.8750.9290.6390.61595% CI0.692-0.8490.750-0.9640.816-1.0000.455-0.8230.395-0.835靈敏度54.1%71.4%85.7%27.8%23.1% 注:CMV:巨細(xì)胞病毒;VZV:水痘-帶狀皰疹病毒;HSV:單純皰疹病毒;EBV:EB病毒;AUC:曲線(xiàn)下面積;CI:置信區(qū)間 Note:CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Epstein-Barr vi-rus;AUC:area under curve;CI:confidence interval

圖1 皰疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒檢測(cè)ROC曲線(xiàn) A:病毒檢測(cè)ROC曲線(xiàn) 角膜樣本AUC=0.858,房水樣本AUC=0.770 B:CMV檢測(cè)ROC曲線(xiàn) 角膜樣本AUC=0.821,房水樣本AUC=0.875 C:VZV檢測(cè)ROC曲線(xiàn) 角膜樣本AUC=0.679,房水樣本AUC=0.929 D:HSV-1檢測(cè)ROC曲線(xiàn) 角膜樣本AUC=1.000,房水樣本AUC=0.639 E:EBV檢測(cè)ROC曲線(xiàn) 角膜樣本AUC=0.962,房水樣本AUC=0.615Figure 1 ROC curves for herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples A:ROC curves for overall viral detection AUC for corneal samples was 0.858,and for aqueous humor samples was 0.770 B:ROC curves for CMV detection AUC for corneal samples was 0.821,and for aqueous humor samples was 0.875 C:ROC curves for VZV detection AUC for corneal samples was 0.679,and for aqueous humor samples was 0.929 D:ROC curves for HSV-1 detection AUC for corneal samples was 1.000,and for aqueous humor samples was 0.639 E:ROC curves for EBV detection AUC for corneal samples was 0.962,and for aqueous humor samples was 0.615

3 討論

針對(duì)不同種類(lèi)的皰疹病毒,抗病毒藥物選擇存在差異。美國(guó)HEDS(The Herpetic Eye Disease Studies)提出,阿昔洛韋對(duì)HSV/VZV感染治療效果較好,之后發(fā)現(xiàn)伐昔洛韋、泛昔洛韋作為其前體藥物更為有效,且給藥方式更為簡(jiǎn)單[15]。更昔洛韋是治療CMV感染的一線(xiàn)用藥[16],在更昔洛韋出現(xiàn)耐藥后,可選擇性使用膦甲酸作為二線(xiàn)用藥。眼部樣本病毒DNA檢測(cè)是目前明確診斷皰疹病毒種類(lèi)的最有效方法,但病毒DNA檢測(cè)結(jié)果假陰性率較高,一些患者往往需要多次送檢才能得到陽(yáng)性結(jié)果[17]。研究不同眼部樣本病毒DNA的檢測(cè)效率有助于盡早明確皰疹病毒種類(lèi),及時(shí)開(kāi)展治療。

本研究排除了同一個(gè)體多種皰疹病毒DNA陽(yáng)性的患者,避免了同一個(gè)體不同皰疹病毒在角膜分布層次上造成的混雜。本組皰疹病毒陽(yáng)性的角膜移植患者中,CMV DNA的檢出率最高,與歐美等國(guó)家的報(bào)道有所區(qū)別。CMV在亞裔人群中檢出率較高,尤其在內(nèi)皮病變患者中發(fā)生率更高[18]。在角膜內(nèi)皮層的皰疹病毒DNA分布中,CMV和VZV DNA分別位于第1位和第2位,因此應(yīng)引起眼科醫(yī)生警覺(jué)。

本研究發(fā)現(xiàn),皰疹病毒在角膜和房水樣本中病毒DNA檢測(cè)效率可能與皰疹病毒DNA的角膜分布層次和潛伏位點(diǎn)有關(guān)。CMV和VZV DNA多分布于角膜內(nèi)皮層,在病毒DNA檢測(cè)中,房水的檢出率和檢測(cè)效率均高于角膜。這可能是由于病毒在角膜內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)不斷復(fù)制,裂解細(xì)胞釋放病毒,從而引起房水中病毒滴度升高[18];而角膜內(nèi)皮層在移植術(shù)前往往僅殘留極少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞,因此病毒滴度低于其在房水中的滴度。研究認(rèn)為CMV角膜炎可能來(lái)自體內(nèi)皰疹病毒的再激活,CMV透過(guò)血-房水屏障到達(dá)前房,感染角膜內(nèi)皮細(xì)胞、小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞等,進(jìn)而引發(fā)廣泛的眼前節(jié)炎癥反應(yīng)[19-22]。HSV-1和EBV的角膜感染多發(fā)生于基質(zhì)層,在病毒DNA檢測(cè)中,角膜的檢出率和檢測(cè)效率高于房水。這可能是由于HSV-1復(fù)制產(chǎn)生的病毒難以突破后彈力層及內(nèi)皮層進(jìn)入房水,從而積聚在角膜中造成的。研究顯示,HSV-1和EBV在角膜、房水、淚液中均可檢測(cè)到[5,23],但未見(jiàn)各種樣本檢出率的比較研究。對(duì)于HSV-1角膜感染,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)認(rèn)為其來(lái)自于潛伏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病毒再激活,沿神經(jīng)軸突逆行引起角膜上皮炎或基質(zhì)炎[24],這與本研究中HSV-1 DNA角膜分布層次的研究結(jié)果相一致。

本研究探討了皰疹病毒陽(yáng)性的角膜移植患者這一特定人群中皰疹病毒DNA在角膜組織中的分布,屬于抽樣調(diào)查,在一定程度上反映了人群中皰疹病毒陽(yáng)性患者在角膜組織間的分布特點(diǎn),為今后的相關(guān)研究提供了參考。

總之,本研究結(jié)果顯示在皰疹病毒陽(yáng)性的角膜移植患者中,CMV DNA的檢出率最高,CMV和VZV DNA多在角膜內(nèi)皮層被檢出,HSV-1和EBV DNA多在角膜基質(zhì)層被檢出。在針對(duì)角膜和房水對(duì)皰疹病毒角膜感染檢測(cè)效率的評(píng)估中,對(duì)皰疹病毒整體而言,角膜的病毒檢測(cè)靈敏度高于房水;對(duì)于具體的皰疹病毒而言,CMV和VZV房水檢測(cè)敏感性高于角膜組織,HSV-1和EBV角膜檢測(cè)敏感性高于房水。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明臧云曉:直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草及修改文章;彭榮梅:設(shè)計(jì)試驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù),對(duì)文章內(nèi)容審閱和修改;肖格格:采集數(shù)據(jù)、起草文章、對(duì)文章內(nèi)容審閱和修改;何林輝:設(shè)計(jì)試驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章;洪晶:采集數(shù)據(jù)、對(duì)文章內(nèi)容審閱和修改及定稿