馬驕 申展 胡博浩 趙英涵 劉姝婉 吳蓉 彭榮梅 洪晶

北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科 眼部神經(jīng)損傷的重建保護(hù)與康復(fù)北京市重點實驗室,北京 100191

吳蓉現(xiàn)在北京大學(xué)深圳醫(yī)院眼科,深圳 518000

同種異體造血干細(xì)胞移植術(shù)(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是目前治療多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效手段,慢性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是異基因HSCT術(shù)后的常見并發(fā)癥,發(fā)生率為30%～70%,主要由供體淋巴細(xì)胞受激活攻擊宿主靶器官引起[1-3]。慢性GVHD主要表現(xiàn)為長期的慢性炎癥過程,其表現(xiàn)類似于干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[4-5]。60%～90%慢性GVHD患者可發(fā)生眼部GVHD(ocular GVHD,oGVHD),造成角結(jié)膜組織炎癥、淚腺纖維化、瞼板腺萎縮等多種眼表組織損害[6-7],主要臨床癥狀為眼干、眼紅、眼痛、畏光、有異物感等,若不及時治療可能會發(fā)展為角膜炎、角膜潰瘍或穿孔,嚴(yán)重者導(dǎo)致視力下降,甚至盲[8-10]。目前,oGVHD尚缺乏規(guī)范的臨床治療方案,主要治療原則為潤滑眼表和控制炎癥,如采用人工淚液、生長因子類藥物滴眼液點眼以緩解干眼癥狀并保護(hù)眼表組織的結(jié)構(gòu)完整性和功能,同時局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合免疫抑制劑控制慢性炎癥過程[11-13]。臨床實踐中發(fā)現(xiàn),大部分患者經(jīng)過1個月的治療后干眼及眼表炎癥可明顯緩解,但部分患者治療后癥狀改善不明顯,甚至加重。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑他克莫司和環(huán)孢素滴眼液是oGVHD常用的免疫治療藥物,然而,由于oGVHD患者發(fā)病情況比較復(fù)雜,這2種藥物所適應(yīng)的oGVHD患者是否存在差異,以及造成這種差異的潛在機制尚不明確,而針對不同oGVHD患者的具體情況用藥對提高療效具有重要臨床意義。慢性oGVHD病理過程受多種免疫細(xì)胞及相關(guān)炎癥因子調(diào)節(jié),檢測患者淚液中特定的炎癥因子是監(jiān)測慢性oGVHD病情變化、研究相關(guān)病理機制的可行方法[14]。近年來,隨著微量蛋白檢測技術(shù)的進(jìn)步,淚液炎癥因子檢測已成為研究oGVHD的重要手段。多項研究表明,淚液中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等含量的改變有助于預(yù)測慢性oGVHD的發(fā)生,此外IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等炎癥因子含量變化程度有助于判斷慢性oGVHD的嚴(yán)重程度[15-20]。本研究團隊在前期研究中也發(fā)現(xiàn),淚液中IL-6和IL-8含量的改變與慢性oGVHD的治療效果有關(guān)[21]。因此我們推測,淚液中炎癥因子含量的動態(tài)改變或有助于揭示影響他克莫司和環(huán)孢素滴眼液治療慢性oGVHD效果的分子機制。本研究擬比較采用1%他克莫司滴眼液和0.05%環(huán)孢素滴眼液治療慢性oGVHD患者干眼相關(guān)指標(biāo)及淚液炎癥因子的不同變化,探討影響oGVHD對不同治療藥物反應(yīng)的因素,為臨床上oGVHD治療的藥物選擇及預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

表1 2個組患者基線特征比較Table 1 Comparison of demographics between two groups項目他克莫司組(n=21)環(huán)孢素組(n=12)χ2/Z值P值性別構(gòu)成比(男/女,n)a10/118/41.1170.291年齡[M(Q1,Q3),歲]b25(11,37)40(15,43)-1.2920.203OSDI評分[M(Q1,Q3),分]b29(26,59)43(14,58)-0.2340.825角膜熒光素鈉染色評分[M(Q1,Q3),分]b13(6,15)10(4,15)-1.0250.314BUT[M(Q1,Q3),s]b2(1,2)2(1,3)-0.4760.659SⅠt[M(Q1,Q3),mm/5 min]b1(1,2)1(1,2)-0.5010.625淚液IL-6質(zhì)量濃度[M(Q1,Q3),pg/ml]b143.2(66.1,232.2)77.8(26.3,544.3)-0.1500.897淚液IL-8質(zhì)量濃度[M(Q1,Q3),pg/ml]b4 568(1 905,9 420)6 530(1 540,8 761)-0.0750.956淚液IL-17質(zhì)量濃度[M(Q1,Q3),pg/ml]b31.7(7.5,57.9)36.0(15.3,52.1)-0.2250.832淚液EGF質(zhì)量濃度[M(Q1,Q3),pg/ml]b86.8(36.0,218.5)139.7(42.8,286.2)-0.8230.427淚液TNF-α質(zhì)量濃度[M(Q1,Q3),pg/ml]b12.0(5.3,38.5)39.7(11.7,87.2)-1.8710.063 注:(a:χ2檢驗;b:Mann-Whitney U檢驗) OSDI:眼表疾病指數(shù);BUT:淚膜破裂時間;SⅠt:Schirmer試驗Ⅰ;IL:白細(xì)胞介素;EGF:表皮生長因子;TNF:腫瘤壞死因子 Note:(a:χ2 test;b:Mann-Whitney U test) OSDI:Ocular Surface Disease Index;BUT:break-up time;SⅠt:Schirmer Ⅰ test;IL:interleukin;EGF:epidermal growth factor;TNF:tumor necrosis factor

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用隨機對照研究方法,納入2020年4月至2021年4月于北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科確診為慢性oGVHD的患者60例60眼,采用隨機數(shù)字表法隨機分為他克莫司組30例30眼和環(huán)孢素組30例30眼。用藥后1個月隨訪患者信息,排除不符合標(biāo)準(zhǔn)的患者,將他克莫司組21例21眼和環(huán)孢素組12例12眼納入后續(xù)研究。病例納入標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)2014年美國國家衛(wèi)生研究院共識,納入慢性GVHD且合并新發(fā)干眼患者。干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2013年版《干眼臨床診療專家共識》:(1)有干燥感、異物感、灼燒感、疲勞感、不適感、視力波動等眼部主觀癥狀之一,淚膜破裂時間(break-up time,BUT)≤5 s或Schirmer試驗Ⅰ(Schirmer Ⅰ test,SⅠt)≤5 mm/5 min,可診斷干眼;(2)有上述主觀癥狀之一,5 s≤BUT≤10 s或SⅠt≤10 mm/5 min時,若角膜熒光素鈉染色陽性,可診斷干眼[22]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)在過去6個月內(nèi)有眼科手術(shù)史;(2)患有其他眼部疾病,如自身免疫性疾病、青光眼、嚴(yán)重感染、視網(wǎng)膜病變、眼部變態(tài)反應(yīng)、白內(nèi)障、眼外傷等;(3)入組前眼部曾使用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素;(4)依從性差,不能定期隨訪者。2個組間患者性別分布、年齡、干眼相關(guān)指標(biāo)、淚液因子水平等基線特征比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)(批文號:M2020489)。所有患者均了解本研究目的和方法并自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1治療方法 2個組分別采用不同的免疫抑制劑局部點眼,他克莫司組主要采用0.1%他克莫司滴眼液(日本千壽制藥株式會社)點眼,2次/日;環(huán)孢素組采用0.05%環(huán)孢素滴眼液(沈陽興齊眼藥股份有限公司)點眼,4次/日。此外,2個組患眼均采用0.1%氟米龍滴眼液[參天制藥(中國)有限公司]2次/日、小牛血去蛋白提取物眼用凝膠(沈陽興齊眼藥股份有限公司)3次/日、0.1%玻璃酸鈉滴眼液(德國URSAPHARM Arzneimittel GmbH公司)8次/日點眼,進(jìn)行抗炎和潤滑治療。

1.2.2有效性指標(biāo)評估 記錄治療前及治療后1個月檢查結(jié)果。療效指標(biāo)包括治療前后干眼癥狀評分、角膜熒光素鈉染色評分和BUT。(1)干眼癥狀評分 采用眼表疾病指數(shù)(Ocular Surface Disease Index,OSDI)問卷進(jìn)行評估,OSDI評分=(100×得分總和)/(4×回答問題總數(shù))[23-24]。(2)角膜熒光素鈉染色評分 用1滴無菌生理鹽水潤濕熒光素鈉眼科檢測試紙,將試紙條輕輕接觸患者下眼瞼結(jié)膜囊,囑患者瞬目,使熒光素鈉染液與淚液混合后,裂隙燈顯微鏡(德國蔡司公司)鈷藍(lán)光下觀察患者角膜染色點數(shù)。將角膜分為5個象限,每個象限根據(jù)染色點數(shù)進(jìn)行角膜熒光素鈉染色評分。無染色為0分;染色點1～30個為1分;染色點>30個但無融合為2分;可見角膜絲狀物附著、點狀角膜病變?nèi)诤?、角膜潰瘍?yōu)?分;每眼最終評分為5個象限的評分之和[24]。(3)BUT 囑患者瞬目3次,雙眼平視前方,用裂隙燈顯微鏡在鈷藍(lán)光下觀察患者末次瞬目至角膜出現(xiàn)首個黑斑的時間,重復(fù)測量3次,取平均值。

1.2.3淚液收集與檢測 用30 μl無菌生理鹽水點眼,利用毛細(xì)管吸取沖洗液并收集于無菌EP管中,-80 ℃冰箱中保存。采用Luminex液相芯片法測定淚液中IL-6、IL-8、IL-17、EGF和TNF-α含量。將淚液標(biāo)本置于冰上溶解,3 000×g離心10 min,取25 μl上清進(jìn)行檢測。參照ProcartaPlex多重免疫分析試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司)說明書的方法梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,采用超聲破碎儀(VCX130,美國Sonics公司)處理預(yù)混合微球30 s,渦旋振蕩器上振蕩1 min,按每孔25 μl加入板中。取25 μl處理好的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、空白對照分別加入對應(yīng)孔中并貼上封口膜,放置在平板搖床上,于4 ℃避光振蕩過夜。采用洗滌緩沖液洗板3次,每孔加入25 μl二抗,平板搖床上室溫避光孵育2 h。每孔加入25 μl鏈酶親和素-藻紅蛋白,在平板搖床上室溫避光孵育30 min,采用洗滌緩沖液洗板3次。每孔加入150 μl鞘液,搖床上室溫避光振蕩5 min。將平板置入Luminex 200檢測儀器(美國賽默飛世爾科技公司),分析每孔平均熒光強度,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算樣品中各細(xì)胞因子質(zhì)量濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實不符合正態(tài)分布,以M(Q1,Q3)表示。他克莫司組與環(huán)孢素組治療前后各指標(biāo)的差值比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)表示,組間差異比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2個組患眼治療前后干眼相關(guān)指標(biāo)差值比較

他克莫司組和環(huán)孢素組治療后OSDI評分分別為33(16,41)分和10(9,17)分,角膜熒光素鈉染色評分分別為3(2,6)分和3(1,5)分,BUT分別為2(2,4)s和4(2,4)s。治療前后環(huán)孢素組OSDI評分改善程度明顯優(yōu)于他克莫司組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.547,P=0.009)。2個組間治療前后角膜熒光素鈉染色評分差值和BUT差值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.526、-0.804,均P>0.05)(表2)。

表2 2個組患者治療前后OSDI評分、角膜熒光素鈉染色評分和BUT差值比較[M(Q1,Q3)]Table 2 Comparison of OSDI score,corneal fluorescein staining scoreand BUT differences before and after treatment between twogroups [M(Q1,Q3)]組別眼數(shù)治療前后差值OSDI評分(分)角膜熒光素鈉染色評分(分)BUT(s)他克莫司組210.4(-5.6,21.5)5.0(2.5,10.0)0.0(-3.0,0.0)環(huán)孢素組1227.2(4.6,45.0)3.5(-0.5,13.8)-1.5(-3.0,0.0)Z值-2.547-0.526-0.804P值0.0090.6110.437 注:(Mann-Whitney U 檢驗) OSDI:眼表疾病指數(shù);BUT:淚膜破裂時間 Note:(Mann-Whitney U test) OSDI:Ocular Surface Disease Index;BUT:break-up time

2.2 2個組患眼治療前后淚液炎癥因子質(zhì)量濃度差值比較

他克莫司組治療后淚液中IL-6、IL-8、IL-17、EGF和TNF-α質(zhì)量濃度分別為49.8(26.3,91.5)、2 432(957,3 882)、9.6(4.8,47.2)、66.5(26.0,219.1)和14.7(2.5,27.4)pg/ml,環(huán)孢素組分別為45.5(10.7,243.9)、3 779(195,7 774)、27.5(12.7,40.6)、39.0(21.9,391.0)和20.0(8.7,47.6)pg/ml。2個組治療前后IL-6、IL-8、IL-17、EGF和TNF-α質(zhì)量濃度差值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.487、-0.112、-0.412、-1.085、-1.198,均P>0.05)(表3)。

表3 2個組患眼治療前后IL-6、IL-8、IL-17、EGF和TNF-α質(zhì)量濃度差值比較[M(Q1,Q3),pg/ml]Table 3 Comparison of IL-6,IL-8,IL-17,EGF and TNF-α concentrations differences before and after treatment between two groups [M(Q1,Q3),pg/ml]組別眼數(shù)治療前后差值IL-6IL-8IL-17EGFTNF-α他克莫司組2158.7(-22.2,142.7)1 187(-170,5 054)1.0(-22.0,34.9)2.6(-70.2,65.3)1.2(-5.4,8.8)環(huán)孢素組1241.5(3.5,243.2)1 547(151,5 431)7.5(-1.3,27.4)63.0(-19.1,145.7)10.4(-4.3,41.2)Z值-0.487-0.112-0.412-1.085-1.198P值0.6450.9270.6910.2910.242 注:(Mann-Whitney U 檢驗) IL:白細(xì)胞介素;EGF:表皮生長因子;TNF:腫瘤壞死因子 Note:(Mann-Whitney U test) IL:interleukin;EGF:epidermal growth factor;TNF:tumor necrosis factor

3 討論

IL-6是一種典型的多效性細(xì)胞因子,在正常機體免疫中發(fā)揮重要功能,異常表達(dá)時可能會引發(fā)多種免疫性疾病[25]。目前,已有多項研究報道了IL-6在慢性oGVHD患者淚液中的異常高表達(dá),且IL-6的含量與該病的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[15-17],這些研究表明IL-6異常高表達(dá)與慢性oGVHD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),提示IL-6或許是治療慢性oGVHD的重要靶點。本研究結(jié)果顯示,點眼治療后1個月,2個組患者淚液中IL-6含量均降低,但2個組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示1%他克莫司滴眼液與0.05%環(huán)孢素滴眼液在調(diào)節(jié)IL-6表達(dá)方面無顯著差異。IL-8是一種低相對分子質(zhì)量多肽,其特征性生物效應(yīng)主要包括趨化及激活中性粒細(xì)胞[26],提示0.1%他克莫司滴眼液對慢性oGVHD的治療效果或與其調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的功能相關(guān)。有研究在慢性oGVHD患者淚液沖洗物的涂片中觀察到中性粒細(xì)胞相關(guān)成分[20],我們在臨床檢查中也發(fā)現(xiàn)部分患者經(jīng)結(jié)膜印跡細(xì)胞檢查可檢出中性粒細(xì)胞浸潤。本研究結(jié)果顯示,2種滴眼液在調(diào)節(jié)oGVHD患者眼表中性粒細(xì)胞功能方面無顯著差異。

本研究結(jié)果顯示,治療后環(huán)孢素組患者的OSDI評分改善程度明顯優(yōu)于他克莫司組,提示經(jīng)0.05%環(huán)孢素滴眼液治療后患者眼表舒適度更佳,這可能與0.1%他克莫司滴眼液具有一定刺激性而引發(fā)患者眼表的不適感有關(guān)。這提示我們,對于未檢出中性粒細(xì)胞浸潤的慢性oGVHD患者,應(yīng)用0.05%環(huán)孢素滴眼液進(jìn)行治療可能有更好的舒適度。

本研究的不足之處主要在于隨訪時間較短,未能對淚液炎癥因子的含量進(jìn)行多個時間點的檢測,且樣本量較小,也可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏倚。因此,本研究結(jié)果仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗證。

綜上所述,本研究結(jié)果表明2種藥物在調(diào)節(jié)慢性oGVHD患者淚液中各因子表達(dá)方面無顯著差異。此外,慢性oGVHD患者應(yīng)用0.05%環(huán)孢素滴眼液治療可能比0.1%他克莫司滴眼液有更好的舒適度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明馬驕:設(shè)計試驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、文章撰寫;申展、胡博浩、趙英涵、劉姝婉、吳蓉:實施研究、采集數(shù)據(jù);彭榮梅:實施研究、采集數(shù)據(jù)、指導(dǎo)試驗;洪晶:醞釀和設(shè)計試驗、實施研究、對文章的知識性內(nèi)容作批判性審閱及定稿