林青 劉艷霞 佟慶 陳雨 顏芳 邢玉

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一種以內(nèi)分泌紊亂為主、多種代謝異常導致的異質(zhì)性臨床綜合征,因其發(fā)病機制始終尚未明確,該病一直是婦科臨床的難點重點。中醫(yī)藥治療PCOS療效突出,國醫(yī)大師柴嵩巖治療本病頗有心得,其自擬方“歸術(shù)益坤方”已通過臨床試驗[1]證實,該方對于改善PCOS患者相關(guān)癥狀效果明確。本課題組前期研究通過大鼠及細胞實驗證實,歸術(shù)益坤方可以影響卵巢顆粒細胞自噬,發(fā)揮治療效果[2],但該方對于PCOS的具體治療機制尚不明確,需進一步細化。歸術(shù)益坤方中多味中藥被證實對于腸道菌群調(diào)控具有一定影響,本實驗復制來曲唑誘導的大鼠模型,以歸術(shù)益坤方進行干預,觀察中藥對PCOS大鼠體質(zhì)量、卵巢大小及形態(tài)、血清睪酮、空腹血糖、脂多糖(ipopolysaccharide,LPS)、相關(guān)炎癥因子、卵巢組織中Toll樣受體4(toll like receptor-4,TLR-4)表達的影響,研究歸術(shù)益坤方通過調(diào)控LPS/TLR-4通路治療PCOS的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級6周齡雌性SD大鼠18只,體質(zhì)量(180±15)g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級屏障環(huán)境,12小時光照/黑夜循環(huán),溫度25 ℃,濕度60%,自由攝食飲水。本研究已通過北京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審查,倫理審查批號:BUCM-4-2018101001-4030。

1.2 實驗藥物、主要試劑與儀器

歸術(shù)益坤方顆粒劑(菟絲子20 g、白術(shù)15 g、當歸15 g、南沙參12 g、車前子15 g、茜草12 g、絲瓜絡(luò)10 g、浙貝母10 g),購于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院,常規(guī)開水沖泡,制成藥液每mL含3 g顆粒劑;來曲唑片,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號:190316KG,將來曲唑溶于1%羧甲基纖維素(carboxylmethyl cellulose,CMC)溶液中,每mL含0.5 mg來曲唑藥粉。

血清睪酮(testosterone,T)測定試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所,批號:20190602);白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20190404);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20190410);LPS酶聯(lián)免疫試劑盒(上海赫澎生物科技有限公司,批號:HPBIO-Elisa711);血糖酶法試劑盒(北京百奧泰康生物技術(shù)有限公司,批號:DL201901)。離心機(恒諾儀器,AXTGL16M);切片機(Leica,RM2235);電子天平(Sartorius公司,Cubis?MSA224S-000-DA);石蠟包埋機(Leica G1150H);全自動生化儀(日本奧林巴斯株式會社,AU480);γ 放射免疫計數(shù)器(西安核儀器廠,XH-6080);全自動酶標儀(THERMO V.2.3);電泳儀(biorad,EPS 300);凝膠成像儀(biorad,2500)。兔抗大鼠TLR-4抗體(Abcam,Ab13556),山羊抗兔IgG(MDL公司,MD912577)。

1.3 分組、造模及給藥

采用隨機數(shù)字表法將18只大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥組,每組各6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)后模型組及中藥組大鼠按1 mg/(kg·d)連續(xù)灌服來曲唑藥液21天; 空白組連續(xù)灌服同體積CMC溶液21天,復制PCOS大鼠模型[3]。第22天開始,中藥組加灌歸術(shù)益坤方藥液3 g/(200 g·d),模型組及空白組加灌同體積蒸餾水,連續(xù)28天。造模及給藥過程中無大鼠死亡。

1.4 取材

最后1次給藥后,大鼠饑餓12小時,腹腔注射0.4%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉,75%酒精消毒腹部皮膚,打開腹腔,腹主動脈取血,1500 轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,收集血清。取大鼠雙側(cè)卵巢,右側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛固定,左側(cè)卵巢-80℃保存。

1.5 大鼠形態(tài)學監(jiān)測

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,每隔7天測量各組大鼠體質(zhì)量,第1天給藥前和最后1次給藥后測量大鼠身長(鼻尖至肛門的距離),按公式計算Lee’指數(shù)[4],比較實驗前后大鼠體質(zhì)量及Lee’指數(shù)。公式如下:

Lee’s =體質(zhì)量(g)^(1/3)×103/體長(cm)

1.6 大鼠動情周期監(jiān)測

在取材前一周,監(jiān)測大鼠陰道脫落細胞涂片,比較三組大鼠動情周期的變化[5],并分別繪制動情周期曲線圖。

1.7 大鼠卵巢形態(tài)和病理切片變化

取材時,大鼠卵巢取出后立即對大鼠雙側(cè)卵巢分別稱重,測量雙側(cè)卵巢長、寬和厚,比較三組大鼠卵巢體積。通過HE染色右側(cè)卵巢組織,比較各組卵巢病理切片變化。

1.8 血清學檢測

比較三組大鼠血清睪酮(testosterone,T)、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)水平。T水平采用放射免疫法檢測,FPG水平采用干化學法檢測,血清IL-18、TNF-α、LPS水平采用ELISA法檢測。

1.9 Western-blot法檢測TLR-4蛋白表達

卵巢組織研磨勻漿后提取總蛋白,BCA蛋白定量法測定蛋白濃度,蛋白上樣Buffer將蛋白定量為5 mg/mL。制備SDS-PAGE凝膠,上樣,電泳。濕轉(zhuǎn)法65V轉(zhuǎn)膜2小時至PVDF膜上,置封閉液中封閉1小時。加入一抗(1∶1000稀釋)4℃孵育過夜,TBST緩沖液室溫下緩慢搖動洗滌三次,每次10分鐘。二抗用TBST稀釋300倍,室溫、避光緩慢搖動作用1小時。洗膜后用ECL發(fā)光試劑盒顯色,化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內(nèi)參(β-actin)灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和Lee’s指數(shù)比較

造模前,三組大鼠體質(zhì)量和Lee’s指數(shù)均無明顯差異(P>0.05);實驗結(jié)束后,模型組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)均顯著高于空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

給中藥前,模型組大鼠和中藥組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);給藥后,中藥組大鼠體質(zhì)量較模型組顯著下降(P<0.01),Lee’s指數(shù)較模型組無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。具體結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量和Lee’s指數(shù)比較

2.2 各組大鼠動情周期監(jiān)測結(jié)果

空白組大鼠可以觀察到完整動情周期,模型組大鼠未見規(guī)律動情周期, 出現(xiàn)動情周期紊亂、 發(fā)情期縮短或無動情周期波動,中藥組大鼠造模結(jié)束后出現(xiàn)動情周期消失或紊亂,給藥結(jié)束后,動情周期波動好轉(zhuǎn),觀察后期可見完整動情周期,部分中藥組大鼠實驗后期動情周期呈規(guī)律波動狀態(tài),具體見圖1。

注:A:空白組;B:模型組;C:中藥組。

2.3 各組大鼠血清睪酮水平、空腹血糖水平比較

與空白組相比,模型組大鼠T水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,中藥組大鼠T值降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白組相比,模型組大鼠FPG水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),中藥組大鼠FPG水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠給藥后血清睪酮、空腹血糖水平比較

2.4 三組大鼠卵巢重量及體積比較

左卵巢重量:模型組大鼠較空白組有所增加(P<0.05),中藥組大鼠較空白組顯著增加(P<0.01),中藥組大鼠較模型組無明顯差異(P>0.05)。

右卵巢重量:模型組大鼠、中藥組大鼠較空白組均顯著增加(P<0.01),中藥組大鼠較模型組無明顯差異(P>0.05)。

左卵巢體積:三組間比較均無明顯差異(P>0.05)。

右卵巢體積:模型組大鼠較空白組顯著增大(P<0.01),中藥組大鼠較模型組顯著縮小(P<0.01),空白組大鼠與中藥組之間無明顯差異(P>0.05)。具體結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠給藥后卵巢重量、體積比較

2.5 各組大鼠卵巢組織HE染色觀察

空白組大鼠卵巢可見優(yōu)勢卵泡和黃體;模型組大鼠明顯可見數(shù)個囊狀卵泡,未成熟卵泡數(shù)量一個切面內(nèi)大于12個,未見優(yōu)勢卵泡及黃體,卵泡大小明顯減小,可見閉鎖卵泡,囊泡顆粒細胞層較空白組明顯變薄;中藥組大鼠可見優(yōu)勢卵泡和黃體,未成熟卵泡數(shù)量較模型組減少,但較空白組有所增多,卵泡內(nèi)可見卵丘,顆粒細胞層厚度接近于空白組顆粒細胞層厚度。具體見圖2。

注:A:空白組;B:模型組;C:中藥組。

2.6 各組大鼠血清LPS水平及IL-18、TNF-α促炎因子水平比較

與空白組大鼠相比,模型組大鼠血清LPS水平明顯上升,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),同時血清炎癥因子IL-18、TNF-α水平均顯著上升,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組大鼠相比,中藥組大鼠血清LPS、IL-18均明顯下調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。具體見表4。

表4 各組大鼠給藥后血清LPS、IL-18、TNF-α水平比較

2.7 各組大鼠卵巢組織TLR-4蛋白表達水平比較

空白組相對蛋白灰度比值為(1.00±0.185),模型組為(2.305±0.113),中藥組為(1.474±0.292),從條帶灰度值及相對蛋白灰度比值上看,與空白組比較,模型組大鼠卵巢組織中TLR-4蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.01),中藥組卵巢組織中TLR-4蛋白表達水平較模型組大鼠顯著下調(diào)(P<0.01)。具體見圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織中TLR-4蛋白表達水平

3 討論

PCOS發(fā)病率日益升高,國外育齡期女性中約6%～20%會受到PCOS的影響[6],我國育齡期婦女中PCOS發(fā)病率也達到7.1%～11.2%[7]。PCOS患者因雄激素升高及糖脂代謝紊亂,繼而出現(xiàn)一系列生理癥狀及外貌變化,加之不孕帶來的家庭壓力等社會因素,其心理健康及生活質(zhì)量受到嚴重影響。本課題組前期已通過臨床實驗[1]和大鼠實驗[8]證實,中藥方劑歸術(shù)益坤方對于此病的治療療效顯著。近年來,對于PCOS的診治和研究范疇已經(jīng)遠也涉及代謝性疾病、心血管疾病、腫瘤等多個方面,腸道菌群(gut microbiota,GM)及其代謝產(chǎn)物LPS、短鏈脂肪酸等逐漸被發(fā)現(xiàn)和PCOS的發(fā)病關(guān)系密切[9]。

腸道菌群是腸道微生態(tài)系統(tǒng)核心部分。正常情況下,人體腸道菌群處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但PCOS患者腸道菌群α多樣性降低,同時腸道菌群整體豐度降低[10-11]。腸道菌群豐度降低會表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng),相關(guān)炎癥因子水平更高[12-14]。LPS是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物之一,主要存在于革蘭氏陰性菌細胞外膜層,也是細菌的內(nèi)毒素,機體血清LPS升高,這種現(xiàn)象被稱為“代謝性內(nèi)毒素血癥”[15]。LPS也被認為參于到PCOS的發(fā)生過程中。

3.1 模型評價

本研究中采用來曲唑建立PCOS大鼠模型,在造模前,空白組和PCOS組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)均無明顯差異,經(jīng)過連續(xù)21天來曲唑給藥,模型組和中藥組大鼠體質(zhì)量顯著上升,動情周期明顯紊亂,同時模型組大鼠血清睪酮、空腹血糖明顯上升,雙側(cè)卵巢有不同程度的體積重量增加,卵巢切片也可看見多個小卵泡,HE染色后卵巢病理切片也可以觀察到明顯多于空白組大鼠卵巢組織的未成熟卵泡,未見優(yōu)勢卵泡及黃體,卵泡大小明顯減小的同時可見閉鎖卵泡,可以判斷PCOS大鼠模型建立成功。

從機制相關(guān)研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清LPS高于空白組,TLR-4蛋白表達也較空白組明顯上調(diào),同時模型組大鼠血清IL -6、IL-18和TNF-α顯著高于空白組,這說明本研究中模型組大鼠機體處于慢性炎癥狀態(tài)。有學者認為PCOS腸道菌群變化[16],是菌群內(nèi)過多的LPS透過腸上皮入血,血循環(huán)中內(nèi)皮細胞及脂肪細胞等可識別并攝取LPS,與LPS結(jié)合蛋白結(jié)合,激活CD14受體,三者形成的復合物與TLR4結(jié)合[17-18],從而激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1),進一步介導TNF-α和促炎因子產(chǎn)生,在脂肪組織及肝臟等組織中引起IL-6[19]、IL-18[20]等炎癥因子的釋放,造成慢性低水平炎癥。炎癥因子參于到糖脂代謝的過程中,引發(fā)胰島素抵抗等效應(yīng)[21],最終可出現(xiàn)代謝紊亂并加重高雄激素血癥。

3.2 中藥作用評價

在本研究中,中藥組大鼠體質(zhì)量較模型組顯著下降,并恢復正常動情周期,同時卵巢HE染色切片可以觀察到明確區(qū)別于模型組小卵泡的優(yōu)勢卵泡和黃體,并且中藥組大鼠右卵巢體積較模型組而言有所下降。從各組血清睪酮、空腹血糖數(shù)值比較上看,歸術(shù)益坤方對于PCOS大鼠有顯著的降雄激素、降糖作用。由此可以得出結(jié)論,歸術(shù)益坤方可以降低PCOS大鼠體質(zhì)量,促進其恢復卵巢功能,幫助其規(guī)律排卵,降低其雄激素水平和空腹血糖水平,對于PCOS大鼠治療效果良好。

與此同時,給藥結(jié)束后,中藥組大鼠血清中LPS水平較模型組明顯下降,伴隨炎癥因子IL-18隨之下降,這提示,歸術(shù)益坤方可以降低血清LPS水平,下調(diào)體內(nèi)慢性炎癥水平?，F(xiàn)代藥理研究顯示,歸術(shù)益坤方中部分中藥具有抗炎的作用。有實驗人員利用LSP引發(fā)小鼠炎癥反應(yīng)后,加入部分茜草化學成分后,炎癥狀態(tài)得到緩解[22]。除茜草外,浙貝也被證實,具有良好的抗菌、抗炎的作用[23]。楊新銘等[24]用來曲唑聯(lián)合LPS成功建立了PCOS腎虛血瘀大鼠模型,他認為內(nèi)毒素血癥對應(yīng)中醫(yī)“熱邪”“毒邪”范疇。從歸術(shù)益坤方配伍上看,歸術(shù)益坤方中車前子利濕行水,當歸、茜草入血分化瘀通利,配以浙貝母清熱化痰散結(jié),配以其它補腎健脾藥物,既能給邪以出路,又可補虛扶正,標本兼治,PCOS大鼠體內(nèi)濁熱可除,LPS水平下降,炎癥緩解,代謝異常、排卵異常得到改善。

3.3 創(chuàng)新點

本實驗通過來曲唑建立了PCOS大鼠模型,并成功證實,歸術(shù)益坤方對于來曲唑誘導的PCOS大鼠有明顯的治療作用,可以降低PCOS大鼠體質(zhì)量,促進其恢復卵巢功能,幫助其規(guī)律排卵,降低其雄激素和空腹血糖水平,此過程可能是通過調(diào)控LPS/TLR4通路,下調(diào)LPS,降低大鼠體內(nèi)相關(guān)炎性因子,減輕PCOS大鼠體內(nèi)慢性炎癥程度,降低雄激素水平,調(diào)整動情周期,最終改善卵巢多卵泡狀態(tài)。為臨床中治療PCOS提供了基礎(chǔ)實驗支持,也提供了新的角度和靶點,為今后從腸道菌群及其代謝產(chǎn)物入手探究PCOS發(fā)病及治療機制奠定了基礎(chǔ)。

3.4 不足與展望

本實驗各組例數(shù)太少,血清標本不足,僅在腸道菌群代謝產(chǎn)物LPS及其相應(yīng)通路上進行了研究,同時由于課題組在糞便取樣方面缺乏經(jīng)驗及其它不可抗因素,未能繼續(xù)比較各組大鼠腸道菌群的差異,未能研究歸術(shù)益坤方對于PCOS大鼠腸道菌群的影響,后續(xù)實驗可采用糞菌移植實驗,深入研究誘發(fā)LPS/TLR-4信號通路的菌群結(jié)構(gòu)及歸術(shù)益坤方在治療PCOS過程中對于菌群產(chǎn)生了何種作用。