沈露茜，徐學靜，葉逸繁，陳 卓，陳 蘭，申鈺琪，李紅智*

1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院 神經內科，北京 100050；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 醫(yī)學檢驗部，四川 瀘州 646000；3.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學與生命科學學院 教育部檢驗醫(yī)學重點實驗室，浙江 溫州 325035

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)在神經系統(tǒng)變性疾病的發(fā)病中占第二位,目前主要的治療手段是多巴類藥物,但只能改善部分癥狀,并不能阻止病情進展,更不能治愈。帕金森病的細胞病理特征主要為多巴胺能神經元變性,其發(fā)病可能是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結果,分為家族性和散發(fā)性,其中約95%為散發(fā)性的。線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ(簡稱復合體1)缺陷可導致帕金森病的病理特征和臨床癥狀[1-3]。線粒體功能障礙學說認為,帕金森病(特別是散發(fā)性)的發(fā)病機制是由于線粒體復合體Ⅰ活性降低所致[4-5]。這種在散發(fā)性帕金森病患者中普遍存在的復合體Ⅰ活性降低顯然不全是由于復合體Ⅰ亞基編碼基因的某個突變所致[6]。所以相應的治療策略應該是功能上彌補整個復合體Ⅰ的缺陷。

酵母的線粒體復合體Ⅰ是內NADH脫氫酶(internal NADH dehydrogenase,NDI1)基因表達的NDI1蛋白,雖然由單亞基構成,但有可能同源替代哺乳動物細胞中由45個亞基構成的復合體Ⅰ[7-8]。

本研究采用酵母NDI1的重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus with NDI1, rAAV-NDI1),以魚藤酮誘導經分化的人神經細胞系SH-SY5Y建立帕金森病細胞模型,研究酵母NDI1蛋白對人線粒體復合體Ⅰ功能缺陷和細胞病理特征的改善作用。本研究可以為散發(fā)型帕金森病的酵母NDI1基因治療提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y(美國菌種保藏中心)。

1.1.2 試劑(盒):5型重組腺相關病毒rAAV5-NDI1(委托武漢樞密腦科學技術有限公司包裝);抗人α-突觸核蛋白(α-synuclein)抗體(BD公司);抗人pS129 α-突觸核蛋白抗體(Abcam公司);抗LC3B抗體、抗HA抗體(CST公司);熒光素/熒光素酶化學發(fā)光ATP測定試劑盒、MitoSOXTMRed(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:分為3組,DMSO+空載組(正常對照組)、魚藤酮+空載組(誘導模型組)、魚藤酮+NDI1組(誘導模型的治療組)。2×105個SH-SY5Y細胞鋪于6孔板中,待貼壁后,換為含10 μmol/L全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)的細胞分化培養(yǎng)液(第0天)。于第2天,將rAAV5-NDI1,以感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為4×104,加入含ATRA的培養(yǎng)液中,進行感染。于第4天,去病毒,換含ATRA的培養(yǎng)液,此后于第6天、第8天各換1次含ATRA的培養(yǎng)液。于第8天在含ATRA的培養(yǎng)液中加入1 μmol/L魚藤酮處理24 h。于第9天,收獲細胞用于后續(xù)的檢測。

1.2.2 Western blot檢測標簽蛋白HA(NDI1)、α-突觸核蛋白和pS129 α-突觸核蛋白水平:收集細胞,裂解,離心取上清。測定蛋白濃度后,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜。封閉后,加一抗(1∶1 000的抗HA抗體或α-突觸核蛋白(α-synuclein)抗體或pS129 α-突觸核蛋白抗體)于4 ℃孵育過夜。然后二抗孵育。最后顯影、曝光。

1.2.3 免疫熒光法檢測HA(NDI1)、MitoTracker、LC3B的定位及水平:細胞爬片上的細胞,加100 nmol/L的MitoTrackerTMRed于37℃避光孵育30 min。經固定、通透、封閉后加一抗(1∶100的抗人LC3B抗體或HA抗體)于4 ℃ 避光孵育過夜。加Alexa fluo 647標記的二抗室溫避光孵育1 h后加DAPI染色。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 復合體依賴性氧耗的檢測:于Oxygraph-2K細胞呼吸儀的倉內加入2×106個細胞/2 mL檢測液。加2% 洋地黃皂苷通透細胞膜后,先加入復合體Ⅰ的底物混合物記錄復合體Ⅰ依賴性的氧耗,再加入100 μmol/L的哺乳動物(不包括酵母的)復合體Ⅰ抑制劑魚藤酮,記錄抑制內源性復合體Ⅰ后的氧耗,再加入0.225 mol/L的通用性(包括酵母的)復合體Ⅰ抑制劑黃酮,記錄抑制外源性酵母復合體Ⅰ后的氧耗,然后加入復合體Ⅱ和Ⅲ的底物混合物,記錄復合體Ⅱ和Ⅲ依賴性的氧耗。用DatLab 軟件進行數(shù)據分析。

1.2.5 ATP合成的檢測:收集的細胞(約1×106個)在100 μL ATP提取液中100 ℃加熱90 s。10 μL上清液樣品或ATP標準品與100 μL ATP檢測液混合,用多功能酶標儀進行化學發(fā)光檢測,根據標準曲線計算樣品的ATP水平。除測定未經處理細胞的基礎ATP合成外,另外將細胞與15 mg/L的寡霉素在37 ℃下孵育1 h后,測定抑制ATP合酶后的ATP合成。

1.2.6 線粒體內ROS的測定:收集的細胞(約1×106個),加入5 μmol/L的MitoSOXTMRed于37 ℃避光孵育25 min。洗滌、重懸細胞,流式細胞儀采集5 000個細胞分析每個樣本的中位數(shù)熒光強度(median fluorescence intensity, MFI)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 分化后SH-SY5Y細胞的增殖狀態(tài)、轉導后NDI1的表達及亞細胞定位

SH-SY5Y細胞ATRA處理2 d后增殖變慢,在處理4 d后增殖基本停止(圖1B)。

A.scheme for all-trans retinoic aicd (ATRA) differentiation, rotenone treatment and rAAV5-NDI1 transduction of SH-SY5Y cells; B.proliferation status of ATRA treated SH-SY5Y cells; C.expression of HA (NDI1) on day 6 and 7 after transduction(day 8 and 9); D.subcellular co-localization of MitoTracker and HA (NDI1) on day 6 after introduced, MitoTracker(red), mitochondria;HA(green), HA (NDI1) protein; DAPI(blue), nucleus(scale bar:25 μm).圖1 分化后SH-SY5Y細胞的增殖狀態(tài)、感染后NDI1的表達及亞細胞定位Fig 1 Proliferation status of SH-SY5Y cells after differentiation, and the expression and subcellular localization of

在感染后第6、7天,感染NDI1組的HA(NDI1)的表達水平均較高(圖1C)。

HA(NDI1)與MitoTracker亞細胞共定位,顯示 NDI1蛋白定位于線粒體(圖1D)。

2.2 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后改善細胞病理學特征

魚藤酮+空載組細胞形態(tài)發(fā)生異常改變,胞體變圓并聚集在一起,軸突縮短,細胞間連接變少;魚藤酮+NDI1組形態(tài)明顯改善,胞體皺縮現(xiàn)象改善,數(shù)量增多,細胞伸展,突起變長(圖2A)。

A.cell morphology (scale bar: 100 μm); B.cell viability; C.the α-synuclein (α-syn) and pS129 α-synuclein (pS129 α-syn) levels; D.quantitation of α-synuclein and pS129 α-synuclein levels; *P<0.01, **P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.05, ##P<0.01 compared with rotenone+vector.圖2 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后能改善細胞病理學特征Fig 2 NDI1 improved the cytopathological characteristics after introduced into rotenone-induced differentiated Parkinson’s disease cell n=3)

魚藤酮+空載組與DMSO+空載組相比,細胞存活率顯著下降(P<0.01),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.05)(圖2B)。

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組α-突觸核蛋白和pS129 α-突觸核蛋白水平顯著增加(P<0.001,P<0.01),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.01,P<0.05)(圖2D)。

2.3 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后恢復線粒體復合體Ⅰ依賴性的氧耗水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組復合體Ⅰ依賴性氧耗顯著降低(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.01)(圖3A)。

A:CI-dependent and CⅡ+CⅢ-dependent oxygen consumption levels, CI.complex Ⅰ, CⅡ.complex Ⅱ, CⅢ.complex Ⅲ; B:proportion of flavone or rotenone sensitive in complex Ⅰ-dependent oxygen consumption; *P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.01, ##P<0.001 compared with rotenone+vector.圖3 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后能恢復線粒體復合體Ⅰ依賴性的氧耗水平Fig 3 NDI1 restored mitochondrial complex Ⅰ-dependent oxygen consumption level after transduction into rotenone-induced differentiated Parkinson’s disease cell n=3)

魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組,復合體Ⅰ依賴性氧耗中對黃酮敏感的比例顯著升高(P<0.001),占復合體Ⅰ依賴性氧耗的大部分(圖3B)。

2.4 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后能恢復ATP水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組細胞整體ATP合成量(即base)顯著降低(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.01)(圖4A)。

A.total cellular ATP content (base), oligomycin-sensitive ATP content (oligo-sensitive); B.proportion of oligomycin-sensitive ATP content; *P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.01 compared with rotenone+vector.圖4 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后能恢復ATP水平Fig 4 NDI1 restored ATP level after transduction into the rotenone-induced differentiated Parkinson’s disease

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組對寡霉素敏感的ATP合成量(即oligo-sensitive)及其比例顯著降低(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回升(P<0.01)(圖4A,B)。

2.5 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后能降低ROS水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組線粒體內ROS水平顯著升高(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.01)(圖5)。

MFI.median fluorescence intensity; *P<0.001 compared with DMSO+vector; #P<0.01 compared with rotenone+vector.圖5 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后能降低ROS水平Fig 5 NDI1 reduced the level of ROS after transduction into the rotenone-induced differentiated Parkinson’s

2.6 NDI1導入魚藤酮誘導的分化型帕金森病細胞模型后能降低細胞自噬和線粒體自噬水平

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組自噬標志物LC3B免疫熒光強度顯著提高(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.001)(圖6B)。

魚藤酮+空載組較DMSO+空載組LC3B與Mito-Tracker共定位的Pearson相關系數(shù)顯著提高(P<0.001),魚藤酮+NDI1組較魚藤酮+空載組顯著回落(P<0.001)(圖6C)。

3 討論

魚藤酮是常用的構建帕金森病細胞、動物模型的神經毒素,其主要機制是抑制線粒體復合體Ⅰ[9]。本研究采用魚藤酮來構建帕金森病細胞模型,研究結果顯示復合體Ⅰ相關的線粒體功能低下并出現(xiàn)了帕金森病的細胞病理學特征(圖2～6),表明構建成功。

目前針對線粒體復合體Ⅰ缺陷的基因治療,如 Leber氏視神經病的ND4基因治療已完成臨床前研究并進入臨床試驗[10],還有對Ndufs4全身性敲除的Leigh綜合征模型小鼠采用AAV-Ndufs4進行基因治療[11],但已報道基因治療策略只針對人復合體Ⅰ某一個亞基功能缺陷。本研究的基因治療策略能夠在功能上彌補整個復合體Ⅰ的缺陷,有望應用于所有線粒體復合體Ⅰ缺陷的疾病。

已有一些研究證實了酵母NDI1或其蛋白產物用于復合體Ⅰ缺陷相關疾病治療的有效性。采用體外制備的細胞通透性TAT-NDI1蛋白,能夠使心肌缺血損傷模型大鼠的心肌復合體Ⅰ功能恢復,心梗減小[7]。在多發(fā)性硬化模型小鼠中采用NDI1靶向功能缺陷的復合體Ⅰ,能夠緩解軸突受損和神經元缺失問題,從而改善視覺功能[8]。本研究結果表明, 細胞水平的NDI1治療可以抵抗魚藤酮誘導的細胞形態(tài)改變和存活率下降,使復合體Ⅰ(主要是外源性的)依賴性氧耗、線粒體有關的ATP顯著回升,使線粒體ROS顯著下降并抵抗線粒體自噬(圖2～6),具有與上述文獻報道類似的改善效果。

本研究采用帶有線粒體導肽序列的酵母NDI1,先進入細胞核中,在細胞質中翻譯后轉運到線粒體中。已有研究表明,酵母NDI1在大鼠中沒有引起免疫反應,這可能因為外來蛋白位于線粒體中,可以躲避免疫監(jiān)測之故[12]。

臨床試驗已證明腺相關病毒AAV在帕金森病等神經組織基因治療中具有令人鼓舞的安全性、有效性以及表達的持久性[13-14],故本研究采用AAV作為基因治療表達載體。本研究先采用全反式維甲酸分化SH-SY5Y細胞,停止細胞分裂,然后采用rAAV-NDI1感染分化型帕金森病細胞模型。因為重組腺相關病毒在被感染的細胞中主要是以非整合的形式存在,細胞分裂后的子代細胞中重組基因含量將被稀釋掉[15]。