高子璐 劉玉增 管娟

絲蛋白也稱絲素（silk fibroin，SF），通常指從蠶絲等動物絲中獲取的天然蛋白質(zhì)［1］。蠶絲纖維具備良好的機械強度、韌性、生物相容性，可以直接用作醫(yī)學(xué)植入物或敷料［2-3］。通過溶解蠶絲獲得絲蛋白水溶液的方式，可進(jìn)一步獲得水凝膠、薄膜、微球、支架等多種形態(tài)的絲蛋白材料［4-7］，極大地拓展了絲材料的應(yīng)用范圍［8］。其中水凝膠能夠為細(xì)胞提供類似生物組織中細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境，有利于細(xì)胞黏附、生長和增殖［9-10］，為組織工程提供了一類理想的生物材料。絲蛋白水凝膠由絲蛋白分子通過物理或化學(xué)交聯(lián)形成［11］?？勺⑸渌z能夠配合微創(chuàng)手術(shù)方式，不僅減輕了患者的不適感，還縮短了治療時間，體現(xiàn)更大的經(jīng)濟性［12-13］，在關(guān)節(jié)骨/軟骨組織工程體現(xiàn)很大的臨床應(yīng)用潛力。臨床應(yīng)用對可注射水凝膠的要求還包括優(yōu)異的生物相容性、適宜的粘度、優(yōu)異的力學(xué)性能如韌性和可控的生物降解性等［14］。絲蛋白水凝膠同時具備上述水凝膠的多種性質(zhì)，在力學(xué)性能上其模量可達(dá)到MPa級別［15-16］，滿足骨與軟骨組織工程的需求?？勺⑸渌z分為原位成型水凝膠和剪切變稀水凝膠［17］。原位成型是指通過注射裝置將溶液注入目標(biāo)生物組織后，溶液發(fā)生凝膠化逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟z［18］。在室溫條件下，絲蛋白水凝膠依靠β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變的物理凝膠化時間超過24 h［19］，為滿足臨床要求，需引入可加速凝膠化的分子。本研究制備了一種原位成型絲蛋白基三元復(fù)合水凝膠，以絲蛋白作為連續(xù)網(wǎng)絡(luò)或第 一相、羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC）作為體系的第二相、丙三醇（glycerin，G）作為體系的第三相［20］，丙三醇的三羥基結(jié)構(gòu)能有效促進(jìn)絲蛋白凝膠化［21］。本研究關(guān)注水凝膠的凝膠化過程和流體性質(zhì)，初步驗證了可注射性和快速凝膠化性質(zhì)，并表征了構(gòu)象結(jié)構(gòu)、微觀形貌及力學(xué)性能，為面向骨、軟骨組織工程應(yīng)用開發(fā)可注射水凝膠提供參考。

資料與方法

一、資料

1. 材料：桑蠶繭購自上海復(fù)向科技有限公司；碳酸氫鈉（NaHCO3）、溴化鋰（LiBr）、聚乙二醇（PEG，分子量為100 000）、羥丙基甲基纖維素、透析袋（截留分子量分別為3 500、8 000 ～ 14 000）購自麥克林；丙三醇（glycerin，G）購自現(xiàn)代東方科技發(fā)展有限公司。

2. 絲蛋白溶液的制備：在David Kaplan 實驗室提出的絲蛋白水溶液制備方法基礎(chǔ)上［8］，采用堿性更弱、更為溫和的NaHCO3取代Na2CO3進(jìn)行脫膠處理，將家蠶繭浸泡在沸騰0.02 M NaHCO3溶液中去除外層絲膠蛋白，獲得僅包含絲蛋白的絲芯纖維。之 后 將10 g 脫膠 絲置 于100 ml 濃度9.3 mol/L 的LiBr 溶液，在40 ℃下進(jìn)行溶解，得到絲蛋白的LiBr水溶液。經(jīng)過透析處理及離心去除雜質(zhì)，可得到清澈透明的淺黃色絲蛋白溶液，初始濃度一般為4 wt%左右。制備好的絲蛋白溶液放入4 ℃冰箱保存，1周之內(nèi)開展后續(xù)實驗。標(biāo)定絲蛋白溶液的濃度使用稱重法。取三份絲蛋白溶液滴于玻璃片上，稱量溶液初始質(zhì)量為m0，放入105 ℃烘箱烘干直至恒重mt。依據(jù)下式計算濃度，三次測量取平均值。

為獲得更高濃度的絲蛋白溶液（如12 wt%、8 wt%），采用聚乙二醇溶液反透析的方式，將絲蛋白溶液濃縮至高濃度。

3. 三元溶液及水凝膠的制備：將10 wt% HPMC溶液分別與12 wt% 、8 wt%、4 wt%的SF 溶液及甘油按照表1 所示的質(zhì)量比例進(jìn)行混合，將混合溶液倒入玻璃小瓶內(nèi)，加入轉(zhuǎn)子，在37 ℃恒溫水浴中以500 rpm 轉(zhuǎn)速攪拌10 min，使體系組分充分、均勻混合。在37 ℃恒溫水浴中記錄溶液的凝膠化進(jìn)程，采用倒置法判斷凝膠終點，記錄凝膠時間，觀察凝膠宏觀形貌。設(shè)計5 組三元體系，維持體系總質(zhì)量相同為3 g，調(diào)節(jié)體系中SF溶液、HPMC 溶液、G的質(zhì)量比例。A 組SF 溶液及HPMC 溶液的質(zhì)量相同，均為1 g；B 組SF 溶液的質(zhì)量為1.6 g，HPMC 溶液的質(zhì)量為0.4 g?；旌虾篌w系中SF 和HPMC 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)列于表1右側(cè)。

表1 SF-HPMC-G三元水凝膠樣品

二、方法

1. 傅立葉變換紅外光譜測試（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）：采用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS20，Thermo Fisher Scientific）在表面衰減全反射（attenuated total refraction，ATR）模式下測試樣品的紅外吸收光譜。平衡態(tài)水凝膠先經(jīng)冷凍干燥得到塊體/薄膜試樣后壓片。測試時，先掃描并扣除空氣背景，然后將樣品表面緊貼于ATR 晶體表面采集紅外光譜，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，測試波數(shù)范圍為600～4 000 cm-1。用高斯模型對FTIR 曲線進(jìn)行分峰擬合分析。經(jīng)過基線校準(zhǔn)后，使用PeakFit 分峰軟件對酰胺I 區(qū)（1 600～1 700 cm-1）的吸收譜進(jìn)行分峰處理，設(shè)定半峰寬為5 cm-1，峰的總數(shù)為10，獲得的小峰根據(jù)文獻(xiàn)［22］中所用方法劃分為β-折疊、無規(guī)線團(tuán)/螺旋和β-轉(zhuǎn)角三種構(gòu)象，統(tǒng)計峰的面積計算各構(gòu)象的具體含量。

2. 掃描電鏡表征：掃描電鏡表征采用型號為JSM-6010LA 的掃描電鏡設(shè)備、二次電子模式，電子的加速電壓為20 kV。平衡態(tài)水凝膠經(jīng)過冷凍干燥后得到海綿樣品，經(jīng)過表面噴金處理后，在掃描電子顯微鏡下觀察微觀形貌。

3. 流變學(xué)表征：SF-HPMC-G三元混合溶液的流變行為采用流變儀進(jìn)行表征，儀器型號為DHR-2。使用帕爾帖板和40 mm 鋁平行板夾具，在流動模式下進(jìn)行剪切粘度測試/剪切速率掃描，剪切速率范圍為0.1～1 000 s-1，并在震蕩模式下進(jìn)行動態(tài)粘彈性測試/時間掃描，以確定凝膠時間。

4. 力學(xué)性能測試：SF-HPMC-G三元水凝膠樣品的力學(xué)性能測試采用動態(tài)熱機械分析儀（Q800，TA Instruments，Waters Ltd.）。將8 mm 直徑的三元水凝膠切割成高度為5 mm 的圓柱體壓縮試樣，每組3～5 個。壓縮應(yīng)變速率為20%/min，最大壓縮應(yīng)變設(shè)為-80%。每組樣品獲得3 個有效壓縮力學(xué)數(shù)據(jù)。獲得壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線后，對曲線最初線性段進(jìn)行直線擬合，獲得水凝膠的壓縮彈性模量，每組壓縮模量以±s表示。

結(jié) 果

1. 三元溶液水凝膠的流變行為：流動模式下的剪切速率掃描測試結(jié)果為粘度隨剪切速率變化的曲線（圖1）。震蕩模式下的時間掃描測試結(jié)果為動態(tài)模量隨時間變化的曲線（圖2）。樣品A-SF12 的儲能模量G′和損耗模量G″隨時間變化的曲線，兩條曲線存在一交點，G′和G″的變化可以反映出高分子體系的粘彈性及流動特性變化。在交點前，G″＞G′，體系偏向液體性質(zhì)，表現(xiàn)出更多粘性；在交點后，G′＞G″，體系偏向固體性質(zhì)，表現(xiàn)出更多彈性。因此，體系在整個時間掃描過程中逐漸成膠，曲線交點即為凝膠點。樣品A-SF12 凝膠點附近的模量-時間曲線，表明體系凝膠時間為4 150 s，約為1 h9 min。

圖1 SF-HPMC-G三元溶液的粘度-剪切速率關(guān)系曲線

圖2 A SF-HPMC-G三元溶液A-SF12的模量-時間曲線 B A-SF12的凝膠時間

2. 三元水凝膠的宏觀及微觀形貌：SF-HPMC-G三元水凝膠的宏/微觀形貌（圖3）。水凝膠中SF 含量的不同導(dǎo)致了多孔網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸差別。A組水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較B 組致密，孔尺寸更小。絲蛋白相對含量更高的B組水凝膠比A組水凝膠的β-折疊含量更高；絲蛋白濃度越高，β-折疊構(gòu)象含量越高。

圖3 SF-HPMC-G水凝膠SEM圖 A A-SF12 B A-SF8 C B-SF12 D B-SF8 E B-SF4

3. 三元水凝膠的構(gòu)象結(jié)構(gòu)：傅立葉變換紅外光譜通過識別不同基團(tuán)的特征吸收峰給出化合物及材料的化學(xué)組成和構(gòu)象結(jié)構(gòu)等信息。5種水凝膠樣品都具有β-折疊占主導(dǎo)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。小峰3、4對應(yīng)β-折疊構(gòu)象區(qū)間（1 620～1 640 cm-1），小峰5、6、7 對應(yīng)α-螺旋和無規(guī)線團(tuán)構(gòu)象，小峰8、9、10 對應(yīng)β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象。各水凝膠樣品構(gòu)象的具體含量如圖C 所示。采用紅外光譜表征SF-HPMC-G 三元復(fù)合水凝膠的基團(tuán)組成和絲蛋白構(gòu)象的變化（圖4）。

圖4 A SF-HPMC-G 三元水凝膠的FTIR 譜圖，酰胺鍵的特征吸收峰酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)中心位置在圖中標(biāo)注 B A-SF12 分峰結(jié)果 C 二級結(jié)構(gòu)含量計算

4. 水凝膠的力學(xué)性能：三元水凝膠的壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線及壓縮模量，所有樣品均能承受50%壓縮應(yīng)變而不失效（圖5）。在5 種水凝膠體系中，A-SF-12的壓縮模量最大，為～500 kPa。

圖5 SF-HPMC-G三元水凝膠的 A壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線 B 壓縮彈性模量

討 論

1. 三元溶液/水凝膠的流變行為：流動模式下的剪切速率掃描測試結(jié)果為粘度隨剪切速率變化的曲線，如圖1所示。隨著剪切速率的升高，溶液的粘度整體呈現(xiàn)降低趨勢，即表現(xiàn)出“剪切變稀”行為［23］。剪切速率在10 s-1以上時，大部分三元溶液可以維持10 Pa·s 以下的較低粘度，體現(xiàn)較好的流動性，滿足可注射的要求。由于其余樣品凝膠時間過長，難以滿足注射需要，不再展示。

2. 三元水凝膠的宏觀及微觀形貌：SF-HPMC-G水凝膠呈現(xiàn)典型的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要體現(xiàn)三元水凝膠的主體材料SF 的物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。隨著SF含量增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)致密性提升，孔尺寸減小，其中A-SF12有最小的孔尺寸，形成了最為致密的多孔網(wǎng)絡(luò)。值得注意的是，水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)存在一定的不均勻性，這種三元復(fù)合水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的不均勻性，可能由三相混合過程中局部凝膠化引起。

3. 三元水凝膠的構(gòu)象結(jié)構(gòu)：傅立葉變換紅外光譜通過識別不同基團(tuán)的特征吸收峰給出化合物及材料的化學(xué)組成和構(gòu)象結(jié)構(gòu)等信息。采用紅外光譜表征SF-HPMC-G 三元復(fù)合水凝膠的基團(tuán)組成和絲蛋白構(gòu)象的變化。酰胺鍵的特征吸收峰酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)和酰胺Ⅲ區(qū)。對于SF-HPMC-G三元水凝膠體系，酰胺鍵僅存在于SF 分子中，酰胺Ⅰ區(qū)1 621 cm-1峰、酰胺Ⅲ區(qū)1 232 cm-1峰對應(yīng)于SF 的β-折疊構(gòu)象，而酰胺Ⅰ區(qū)1 650 cm-1峰、酰胺Ⅲ區(qū)1 260 cm-1峰對應(yīng)于SF 的無規(guī)構(gòu)象［24］。此外，F(xiàn)TIR圖中3 280 cm-1峰是由于HPMC 中-OH 的拉伸振動和分子間H-鍵合引起的；2 929-2 931 cm-1峰則是由于-CH3 的拉伸振動，證明了水凝膠中HPMC 的存在。為了探究不同水凝膠中SF構(gòu)象的相對含量，我們對酰胺I譜帶的吸收峰進(jìn)行了分峰處理。

4. 水凝膠的力學(xué)性能：在5 種水凝膠體系中，A-SF-12的壓縮模量最大，為～500 kPa，這一結(jié)果與致密的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和更高的β-折疊構(gòu)象含量相對應(yīng)。對于B 組，隨著SF 濃度的提高，水凝膠的壓縮彈性模量相應(yīng)提升，表明SF濃度是絲蛋白水凝膠體系的模量和強度的主要決定因素。A-SF12 與B-SF8 三元水凝膠中，雖然SF 濃度相近，但HPMC 濃度分別是3.33 wt%、1.33 wt%，A-SF12 更高的壓縮模量也來源于更高的HPMC 含量。因此，SF 作為連續(xù)網(wǎng)絡(luò)和HPMC 作為增強相的含量共同決定了三元水凝膠的力學(xué)性能。

總之，SF-HPMC-G 三元水凝膠具有可注射和快速凝膠化的性質(zhì)，在骨組織工程領(lǐng)域體現(xiàn)應(yīng)用潛力，為可注射絲蛋白基水凝膠的設(shè)計提供了一種思路，有望拓展絲蛋白的應(yīng)用。