韓浩,李曉娟,王珣,冷春旭,趙偉,趙曦,李柱剛

(1.黑龍江大學生命科學學院 農業(yè)微生物技術教育部工程研究中心,黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點實驗室,哈爾濱 150080;2.黑龍江省農業(yè)科學院生物技術研究所,黑龍江省南瓜育種與深加工工程技術研究中心,黑龍江省作物與家畜分子育種重點實驗室,哈爾濱 150028;3.黑龍江省農業(yè)科學院耕作栽培研究所,哈爾濱 150028)

南瓜是葫蘆科南瓜屬一年生蔓性草本植物,其中含有多種活性物質,如氨基酸、蛋白質、維生素等,有較高的營養(yǎng)價值[1],現代藥理學研究表明,南瓜對減肥[2]、燙傷治療[3]、前列腺增生[4]等有一定的效果。

β-胡蘿卜素屬于脂溶性色素,無毒無害,是自然界中普遍存在的天然色素,β-胡蘿卜素是維生素A的重要前體物質,對哺乳動物非常重要,發(fā)揮著巨大作用[5],如抗氧化、抗炎、調節(jié)免疫系統、抗腫瘤等[6-7],并可作為食品添加劑、營養(yǎng)強化劑,在食品或動物飼料中應用,有研究表明β-胡蘿卜素作為飼料可提高喂養(yǎng)動物的抵抗力、繁殖能力、生產力以及幼崽成活率等[8]。

β-胡蘿卜素的提取方法很多,如超聲輔助提取法、離子液體提取法以及微乳法等[9-11]。超聲輔助提取法具有操作簡單、投資費用低、提取率高、環(huán)境污染小等優(yōu)點。前人主要以新鮮南瓜果肉為原料提取β-胡蘿卜素[12-16],或以提取過南瓜多糖的濾渣為原料。本文以南瓜粉為研究對象,將超聲輔助提取法應用于β-胡蘿卜素的提取,并進一步考察其穩(wěn)定性,從而為南瓜β-胡蘿卜素的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜粉:牡丹江康維食品有限責任公司;β-胡蘿卜素(標準品):北京博奧拓達科技有限公司;無水乙醇(分析純):天津市天力化學試劑有限公司;石油醚(分析純):天津市富宇精細化工有限公司。

YH-A10002型電子天平 惠州市英衡電子科技有限公司;KQ-600V型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空汞、B-220型恒溫水浴鍋、RE52CS型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 南瓜中β-胡蘿卜素提取工藝

采用關正萍等[17]的方法并略作修改,提取工藝:南瓜粉→加乙醇混勻→超聲輔助提取南瓜β-胡蘿卜素→過濾→濾液即為β-胡蘿卜素提取液。

1.2.2 單因素試驗設計

1.2.2.1 料液比對β-胡蘿卜素提取率的影響

稱取南瓜粉4 g,固定超聲溫度25 ℃、超聲時間30 min,設置不同料液比梯度1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20 (g/mL)進行提取,然后檢測提取液的吸光度,計算β-胡蘿卜素濃度,參照1.2.4中公式(1)計算提取率。

1.2.2.2 超聲溫度對β-胡蘿卜素提取率的影響

稱取南瓜粉4 g,固定料液比1∶8 (g/mL)、超聲時間30 min,設置不同超聲溫度梯度30,40,50,60,70 ℃進行提取,然后檢測提取液的吸光度,計算β-胡蘿卜素濃度,參照公式(1)計算提取率。

1.2.2.3 超聲時間對β-胡蘿卜素提取率的影響

稱取南瓜粉4 g,固定料液比1∶8 (g/mL)、超聲溫度25 ℃,設置不同超聲時間梯度20,40,60,80,100 min進行提取,然后檢測提取液的吸光度,計算β-胡蘿卜素濃度,參照公式(1)計算提取率。

1.2.3 正交試驗設計

設計L9(33)正交試驗表,以超聲時間(A)、超聲溫度(B)、料液比(C)為主要因素,并且每個因素設置3個水平進行研究,以提取率為指標進行分析,正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.2.4β-胡蘿卜素含量的測定

參考郁興娜[18]的方法繪制β-胡蘿卜素標準曲線,并進行簡單修改,首先稱取20 mgβ-胡蘿卜素標準品,用無水乙醇定容至25 mL,配制成標準溶液,再將標準溶液稀釋至濃度為0.8,0.4,0.2,0.1,0.05 mg/mL,然后將5份標準溶液于444 nm處測定吸光值,繪制成標準曲線,y軸為吸光值,x軸為β-胡蘿卜素濃度。

參考向珊珊等[19]的方法檢測南瓜中β-胡蘿卜素的含量,并進行簡單修改。

(1)

式中:M表示南瓜粉的質量,g;C表示提取液中β-胡蘿卜素濃度,mg/mL;V表示提取液的體積,mL;B表示提取液稀釋倍數。

1.2.5β-胡蘿卜素的純化

在β-胡蘿卜素粗提取液中含有一些醇溶蛋白,為得到更高濃度的提取液,采用皂化反應將其去除。采用呂爽[20]的方法,并進行簡單修改,配制15%的KOH溶液,按體積比2∶1加入β-胡蘿卜素粗提取液中,混勻,放置12 h后過濾,按體積比1∶1加入石油醚進行萃取,其中水相去除,有機相用蒸餾水反復沖洗,直至中性,再用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干,最后配制成0.05%的β-胡蘿卜素醇溶液備用。

1.2.6β-胡蘿卜素穩(wěn)定性試驗

1.2.6.1 光照對β-胡蘿卜素保留率的影響

參考申海進等[21]的方法,并進行簡單修改。配制0.05%南瓜β-胡蘿卜素醇溶液,分別置于光照和黑暗處,每隔1 d(24 h)檢測南瓜β-胡蘿卜素醇溶液的吸光度(A),并根據公式(2)計算保留率。

(2)

式中:A表示所測樣品的吸光度;A0表示對照品的吸光度。

1.2.6.2 溫度對β-胡蘿卜素保留率的影響

參考孫靜亞等[22]的方法。配制0.05%南瓜β-胡蘿卜素醇溶液,在黑暗處分別置于4,20,50,75,100 ℃條件下,每隔1 h檢測南瓜β-胡蘿卜素醇溶液的吸光度(A),并計算保留率。

1.2.6.3 pH對β-胡蘿卜素保留率的影響

參考楊曉玲等[23]的方法。配制0.05%南瓜β-胡蘿卜素醇溶液,用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調pH至4,6,8,10,每隔1 h檢測南瓜β-胡蘿卜素醇溶液的吸光度(A),并計算保留率。

1.2.6.4 金屬離子對β-胡蘿卜素保留率的影響

參考楊德孟[24]的方法。配制0.05%南瓜β-胡蘿卜素醇溶液和0.1 mol/L NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeSO4、ZnCl2、FeCl3、AlCl3溶液,取離子溶液10 mL,加入β-胡蘿卜素醇溶液5 mL,對照組加入蒸餾水10 mL、β-胡蘿卜素醇溶液5 mL,置于-4 ℃下保存,24 h后測定吸光度(A),計算保留率并觀察現象。

1.3 數據處理

使用Excel軟件分析試驗數據,應用SPSSAU進行極差和方差分析,應用OriginPro 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標準曲線

β-胡蘿卜素標準曲線見圖1,方程為y=1.696x+0.027,R2=0.998 8,其中y為吸光度(A),x為β-胡蘿卜素濃度(mg/mL),擬合度較好。

圖1 β-胡蘿卜素標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對β-胡蘿卜素提取率的影響

料液比對β-胡蘿卜素提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對β-胡蘿卜素提取率的影響

由圖2可知,圖線呈現山峰狀態(tài),料液比在1∶8 (g/mL)時為最高點,提取率為1.99%,最高點之前提取率隨料液比的增加略有上升,隨后提取率下降,推測是由于料液比超過1∶8 (g/mL)時,溶液中會出現許多脂溶性物質與乙醇作用,從而抑制了β-胡蘿卜素與之結合,影響了提取率[19],因此選擇最優(yōu)料液比為1∶8 (g/mL)。

2.2.2 超聲溫度對β-胡蘿卜素提取率的影響

超聲溫度對β-胡蘿卜素提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對β-胡蘿卜素提取率的影響

由圖3可知,超聲溫度在30～40 ℃之間時,提取率幾乎不增長,在40～50 ℃之間快速增長,50 ℃之后增長緩慢。在一定范圍內,溫度升高可使提取率增加,而超過50 ℃增長放緩,可能是由于高溫對β-胡蘿卜素產生了降解作用[25],因此選擇最優(yōu)超聲溫度為50 ℃。

2.2.3 超聲時間對β-胡蘿卜素提取率的影響

超聲時間對β-胡蘿卜素提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對β-胡蘿卜素提取率的影響

由圖4可知,超聲時間在20～80 min時,提取率先緩慢增長再迅速增長,在80 min時達到最大,當超過80 min時,提取率逐漸降低,推測可能是超聲時間太長會誘導部分β-胡蘿卜素發(fā)生降解作用[17],因此選擇最優(yōu)超聲時間為80 min。

2.3 正交試驗結果

由表2可知,RA>RB>RC;由表3可知,FA>FB>FC;二者結果一致,因此在超聲輔助乙醇提取南瓜β-胡蘿卜素的過程中,β-胡蘿卜素提取的影響因素主次順序為超聲時間(A)>超聲溫度(B)>料液比(C)。超聲輔助乙醇提取南瓜β-胡蘿卜素的最佳條件為A2B2C2,即最佳工藝為超聲時間80 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶8 (g/mL)。

表2 L9(33)正交試驗設計及結果

表3 正交試驗方差分析結果

2.4 驗證試驗

用正交試驗中的最佳參數A2B2C2進行5組驗證試驗,通過計算得到β-胡蘿卜素提取量為(23.811±0.589) mg/g,和正交表中試驗結果接近,證明該試驗設計結果正確。張德華等[26]采用浸提法提取南瓜中色素,提取量為16.547 mg/g。徐小軍等[27]以鮮南瓜果肉為原料,提取量為0.839 mg/g(鮮質量),提取率的差異可能是提取原料、材料預處理方法以及提取工藝等不同導致。

2.5 β-胡蘿卜素穩(wěn)定性試驗

2.5.1 光照對β-胡蘿卜素保留率的影響

光照和黑暗對其穩(wěn)定性都有一定的影響,光照對β-胡蘿卜素保留率的影響見圖5。

圖5 光照對β-胡蘿卜素保留率的影響

由圖5可知,光照對保留率的影響較顯著,黑暗對其影響較小,在第5天黑暗處樣品保留率下降至88.84%,而光照處樣品保留率下至80.47%,相差8.37%。由此可知光照會加速β-胡蘿卜素的降解,黑暗更利于保存β-胡蘿卜素,但也會有所降解[28]。

2.5.2 溫度對β-胡蘿卜素保留率的影響

由圖6可知,在第1 h,4 ℃樣品保留率下降緩慢,溫度越高,樣品保留率下降越明顯,隨著時間的延長,在4,25,50,75 ℃下β-胡蘿卜素的保留率基本接近,但100 ℃下β-胡蘿卜素降解非常明顯,100 ℃對其穩(wěn)定性的影響較大,在第6 h保留率降到44.45%,因此說明β-胡蘿卜素有一定的耐熱性,但溫度不能太高[25]。

圖6 溫度對β-胡蘿卜素保留率的影響

2.5.3 pH對β-胡蘿卜素保留率的影響

由圖7可知,在酸性(pH 4)和堿性(pH 8,10)條件下,保留率都有所降低。酸性(pH 4)和堿性(pH 8,10)中樣品的保留率都小于pH 6下的保留率,原因可能是在酸性和堿性條件下,部分β-胡蘿卜素被析出或降解。因此,β-胡蘿卜素更適合在中性條件下保存[19]。

圖7 pH對β-胡蘿卜素保留率的影響

2.5.4 金屬離子對β-胡蘿卜素保留率的影響

所測金屬離子均對其穩(wěn)定性產生了一定程度的影響,結果見表4。

表4 金屬離子對β-胡蘿卜素保留率的影響

由表4可知,所測金屬離子中Ca2+和Na+的影響相對較小,放置24 h后保留率在50%左右,Fe2+和Zn2+的影響較大,放置24 h后保留率在10%左右,原因可能是形成大量沉淀,β-胡蘿卜素富集在沉淀中,使得溶液中β-胡蘿卜素含量降低。但是Fe3+的加入使得β-胡蘿卜素的保留率明顯上升,放置24 h后保留率達到了955.37%,原因可能是Fe3+本身帶有更深的黃色,加入后使得吸光度上升[15]。

3 結論

超聲輔助乙醇提取南瓜中β-胡蘿卜素的最佳工藝為超聲時間80 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶8 (g/mL),在此參數下,β-胡蘿卜素提取量為(23.811±0.589) mg/g。

在穩(wěn)定性試驗中,光照、溫度、酸堿性、金屬離子對南瓜中β-胡蘿卜素均有一定的影響,其中光照、溫度和金屬離子對其影響較大,保存時宜放置于避光、低溫處,并注意保存器皿的選擇。不同的pH值會對南瓜中β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性帶來影響,酸性和堿性都會使之降解,中性條件對穩(wěn)定性無明顯影響。所測金屬離子中,Zn2+和Fe3+對南瓜β-胡蘿卜素的影響最強烈。本研究可為南瓜色素在調味品中的應用提供理論參考。