蔡偉藍，王繼紅，許嘉英，張強，任雪晗，黃志凱

（廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510405）

摩法為推拿基礎手法之一，《禮記·內則》曰：“濯手以摩之，去其皽?！薄端貑枴げ∧堋吩唬骸澳χ兄！蹦Ω棺鳛槟Ψㄖ委熎⑽覆∽兊闹匾址ㄖ唬ㄟ^摩法和腹部穴位結合，可調理脾胃功能，達到健脾的作用[1]。正如《理瀹·駢文》所言：“后天之本在脾，調中者摩腹?！逼⑻撟C是中醫(yī)學常見的證型，主要表現(xiàn)為胃納差、脘腹脹滿、大便稀溏等消化系統(tǒng)功能低下狀態(tài)，與胃腸動力障礙有密切聯(lián)系[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究[4]表明，胃腸動力障礙與胃腸平滑肌收縮、舒張有關，而鈣調蛋白（CaM）-肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）信號通路是典型的胃腸道平滑肌信號通路。本課題組前期研究[5]表明，摩腹可以治療脾虛家兔，改善脾虛癥狀。為進一步分析摩腹的手法效應，探討摩腹改善脾虛家兔胃腸動力機制，本研究從CaM-MLCK 信號通路切入，觀察不同頻率摩腹干預對通路中關鍵蛋白CaM、MLCK 的影響，以期為摩腹臨床治療脾虛證提供參考，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級成年新西蘭SD家兔72只，體質量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，購自山東省康大生物科技有限公司，實驗動物生產許可證編號：SCXK（魯）20160002。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學科技園普通級家兔實驗室，在溫度24 ℃、相對濕度50%～70%的環(huán)境中進行為期1周的適應性喂養(yǎng)，期間家兔正常攝食、飲水、自由活動。本動物實驗方案已通過廣州中醫(yī)藥大學科技產業(yè)園動物倫理委員會審批通過（批號：PZ21027）。適應性喂養(yǎng)結束后，隨機分為空白組、模型組、低頻摩腹組、高頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組，每組12只，雌雄各半。

1.2 儀器與試劑調制器、校對器、動態(tài)數(shù)據(jù)采集器、Tekscan 研制的多點薄膜壓力測試系統(tǒng)（MFF）壓力傳感器（上海邑成測試設備有限公司）；人工智能機械臂（疆越科技研制730C 型）；SMA4000 超微量分光光度計（北京Merinton 公司）；ABI7500 熒光定量PCR 儀（美國Life Technology 公司）。ML-9 試劑（為MLCK 選擇性強效抑制劑，北京生物技術有限公司生產，批號：YZM002844）；GAPDH 抗體（兔源）、CaM 抗體（兔源）、MLCK 抗體（兔源）（華安生物公司）；山羊抗兔IgG（H+L）抗體（DL800）（美國Proteintech 公司）；BestarTMqPCR RT KitBestar?、SYBR Green qPCR mastermix（德國DBI公司）。

1.3 手法頻率與壓力值校對本次實驗選取10名測試者，行10 次測試，再將測試者的壓力平均值作為機械臂操作的壓力標準操作值。將數(shù)據(jù)采集器、調制器、傳感器、智能機械臂有序連接，將機械臂置于家兔腹部操作手法，并控制頻率在101～ 150 次/min、201～ 250 次/min 兩個頻率，維持同等力量值操作1 min，觀察壓力曲線變化，建立力-電壓之間的擬合函數(shù)模型y=a+bx，然后通過校對器得出曲線的標準力量值和頻率值。技術人員提前在電腦Dobot Studio 系統(tǒng)上設置，操作智能機械臂在多點薄膜壓力測試系統(tǒng)（MFF）下進行手法操作，手法壓力值以觀察實時采集數(shù)據(jù)為度量標準，其均值應控制在以上標準操作值上下不超過5%[5]。

1.4 造模空白組家兔繼續(xù)給予常規(guī)飼養(yǎng)，其余組采用苦寒瀉下法聯(lián)合饑飽失常法構建脾虛模型[6-7]。方法：將190 g 大黃放入900 mL 水中浸泡20 min，大火煎至沸騰后改小火再煎10 min，加水增至1 140 mL，紗布過濾；再將190 g番瀉葉加入1 140 mL沸水中攪拌浸泡5 min，過濾；將大黃液和番瀉葉液各1 140 mL 混合，溶化152 g 芒硝，最終濃度為6 mL 藥液含大黃2 g、番瀉葉1 g、芒硝0.4 g（大黃∶番瀉葉∶芒硝=5∶2.5∶1）[5]。除空白組外，其他各組家兔按照24 mL/kg 劑量連續(xù)灌胃1周，每日1次。期間飼料量減半，飲水不限制，全程詳細記錄各家兔體質量、進食量、行為學表現(xiàn)及大便變化情況。家兔出現(xiàn)便溏后改灌胃量為18 mL/kg。造模后出現(xiàn)精神萎靡，反應明顯遲鈍，甚至出現(xiàn)膽怯易驚，體質量減輕，食量變小，毛發(fā)色澤黯淡、無光澤，大便干硬或稀溏、難以成形等脾虛癥狀，則表明造模成功[2]。

1.5 干預方法

1.5.1 穴位定位 本實驗選取中脘穴、雙側天樞穴。按《實驗針灸學》[8]定位：中脘穴，位于家兔腹中線上，臍與劍狀軟骨連線中點處；天樞穴，位于家兔臍旁開3 cm處。

1.5.2 手法操作 將家兔固定在操作臺上，呈仰臥位，2 名助手固定住家兔前后肢，剃除腹部毛發(fā)以充分暴露穴位，并用標記筆標識，將傳感器固定在穴位上。在電腦上運行Dobot Studio 軟件，輸入測試時求出的機械臂力值參數(shù)，操作機械臂遠端人體拇指模型于家兔腹部的中脘穴、天樞穴（雙）上行摩腹，全程保證拇指模型與家兔腹部皮膚表面垂直，同時為保證手法力度與波形穩(wěn)定，需時刻留意手法的壓力曲線變化。

1.5.3 分組干預 造模結束后，空白組、模型組不進行任何手法干預；低頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組利用人工智能機械臂進行低頻率（101～150 次/分）摩腹干預；高頻摩腹組、高頻摩腹+抑制劑組利用人工智能機械臂進行高頻率（201～250 次/分）摩腹干預；低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組每次手法干預前行腹腔注射ML-9（2 mg/kg）[9]。每穴操作5 min，3 穴共15 min，每日1次，連續(xù)10 d。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 脾虛觀察指標 記錄所有家兔每日的精神狀態(tài)、毛色、體質量、進食量、二便等情況。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察胃黏膜病理變化 取胃小彎組織，固定，石蠟包埋。將石蠟切片脫蠟至水后，入蘇木素染3～ 8 min，自來水洗；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗；0.6%氨水返藍，流水沖洗；入伊紅染液中染色1～3 min。脫水封片。光鏡下觀察胃黏膜病理變化。

1.6.3 qPCR 法檢測胃小彎組織CaM、MLCK 的mRNA 表達 提取胃小彎組織總RNA，運用紫外分光光度法檢測其純度和濃度，將總RNA 逆轉錄為cDNA。進行PCR 反應，反應程序：95 ℃2 min預變性；95 ℃10 s 變性，60 ℃15 s 退火，72 ℃30 s 延伸，45 個循環(huán)；總延伸為95 ℃10 s，60 ℃3 s，98 ℃10 s。重復操作3次，通過PCR 儀運行ASA-9600 系統(tǒng)軟件得出數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCT法計算目標蛋白的相對表達水平。GAPDH（為內參）、CaM 和MLCK 引物由Life Technology 公司合成，引物見表1。引物的擴增長度均為20 bp。

表1 PCR引物序列信息Table 1 PCR primer sequences information

1.6.4 Western Blot 法檢測胃小彎組織CaM、MLCK 的蛋白表達 取胃小彎組織，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑后勻漿、離心，取上清液（即為所要提取的總蛋白）。利用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白總濃度并調整濃度后上樣、煮沸變性、制膠、電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入CaM、MLCK、GAPDH 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜、山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，顯色，顯影成像，拍照。運用ImageJ 軟件測定條帶灰度值，計算目的蛋白灰度值與內參蛋白GAPDH灰度值的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計方法運用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組家兔脾虛指標比較造模前，各組家兔精神狀態(tài)佳，動作靈活，毛發(fā)順滑有光澤，飲食正常，大便正常，糞便成形。造模后，家兔表現(xiàn)為精神狀態(tài)差，精神萎靡，反應明顯遲鈍，甚至膽怯易驚，毛發(fā)黯淡無光澤，體質量減輕，進食減少，大便干硬或稀溏，表明造模成功；給予摩腹干預后，低頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔反應較治療前敏捷，毛發(fā)逐漸恢復光澤，體質量、飲食較治療前改善，大便性狀逐漸恢復正常，而高頻摩腹組各項指標較治療前均變差，脾虛癥狀加重。

進一步比較各組家兔造模前后體質量、進食量2 個指標。表2、表3 結果顯示：與空白組比較，模型組、低頻摩腹組、高頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔體質量、進食量均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，低頻摩腹組、高頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組的體質量、進食量均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結果進一步證明造模成功。

表2 各組家兔造模前后體質量比較Table 2 Comparison of body mass among each group of rabbits before and after modeling（）

表2 各組家兔造模前后體質量比較Table 2 Comparison of body mass among each group of rabbits before and after modeling（）

注：①P＜0.05，與空白組比較

表3 各組家兔造模前后進食量比較Table 3 Comparison of the amount of food intake among each group of rabbits before and after modeling （）

表3 各組家兔造模前后進食量比較Table 3 Comparison of the amount of food intake among each group of rabbits before and after modeling （）

注：①P＜0.05，與空白組比較

2.2 各組家兔干預后胃黏膜病理變化比較空白組：胃黏膜上皮細胞排列規(guī)則，隱窩及腺體結構清晰；模型組：胃黏膜上皮細胞排列規(guī)則，部分見淋巴細胞浸潤；低頻摩腹組：胃黏膜上皮細胞排列規(guī)則，黏膜稍微疏松水腫；低頻摩腹+抑制劑組：胃黏膜上皮細胞排列規(guī)則，黏膜結構明顯疏松水腫；高頻摩腹+抑制劑組：胃黏膜上皮細胞排列規(guī)則，部分可見柱狀上皮破壞；高頻摩腹組：胃黏膜上皮細胞大部分柱狀上皮破壞，部分淋巴細胞浸潤。與模型組比較，低頻摩腹組、低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔胃小彎組織結構和形態(tài)均有恢復，而高頻摩腹組家兔胃小彎組織結構和形態(tài)損傷均有所加重。見圖1。

圖1 各組家兔干預后胃黏膜病理變化比較（HE染色法，×400）Figure 1 Comparison of histopathological changes in the gastric mucosa among each group of rabbits after intervention（HE staining，×400）

2.3 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA表達水平比較表4結果顯示：與空白組比較，模型組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，低頻摩腹組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA 表達水平上調（P＜0.05），高頻摩腹組CaM、MLCK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組CaM、MLCK mRNA 表達水平亦顯著降低（P＜0.05）；與低頻摩腹組比較，高頻摩腹組家兔MLCK 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of CaM and MLCK in the tissue of the stomach lesser curvature among each group of rabbits（）

表4 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK mRNA表達水平比較Table 4 Comparison of mRNA expression levels of CaM and MLCK in the tissue of the stomach lesser curvature among each group of rabbits（）

注：①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與低頻摩腹組比較

2.4 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK 蛋白表達水平比較圖2、圖3 結果顯示：與空白組比較，模型組家兔胃小彎組織CaM、MLCK 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，低頻摩腹組家兔CaM、MLCK 蛋白表達水平升高（P＜0.05），高頻摩腹組CaM、MLCK 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組CaM、MLCK 蛋白表達水平亦顯著降低（P＜0.05）；與低頻摩腹組比較，高頻摩腹組家兔MLCK蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組家兔CaM、MLCK、GADPH的蛋白電泳圖Figure 2 Protein electrophoresis of CaM，MLCK and GADPH

圖3 各組家兔胃小彎組織CaM、MLCK蛋白表達水平比較Figure 3 Comparison of protein expression levels of CaM and MLCK in the tissue of the stomach lesser curvature among each group of rabbits

3 討論

中醫(yī)認為，“脾”主運化，若飲食失節(jié)、脾失健運，則導致中焦氣機升降失常，脾氣上升受阻，胃氣下降異常而發(fā)病。脾虛是胃腸道疾病發(fā)病的基本病機。平滑肌的收縮與舒張是維持消化功能穩(wěn)定的基礎[10]。解剖學表明，從食管至肛門這一系列器官和組織組成的消化系統(tǒng)，均由平滑肌構成。而CaM-MLCK 通路與胃腸道中維持消化功能的平滑肌收縮與舒張有關[11]，是調節(jié)平滑肌收縮的經典信號通路[4]。在調節(jié)平滑肌收縮時，CaMMLCK 通路作為粗肌絲核心調節(jié)通路，在胃腸道上的平滑肌細胞接收刺激以及信號傳導過程中起關鍵作用[12]。當外部電信號刺激，內質網和胞外的Ca2+濃度發(fā)生變化，胞內Ca2+濃度升高促使Ca2+向胞漿內釋放，進而與胞內鈣調蛋白結合后形成Ca2+-CaM 復合物，此時廣泛分布于平滑肌等肌肉組織中的MLCK 被Ca2+-CaM 復合物激活，發(fā)生絲氨酸殘基磷酸化后激活平滑肌肌球蛋白ATP 水解酶水解ATP，將化學能轉換成機械能，釋放能量后使肌球蛋白能夠沿著肌動蛋白絲滑動，引起平滑肌收縮[13]。故本實驗基于CaM-MLCK 通路探討摩腹手法效應。

“補瀉”的合理運用是中醫(yī)治療的基本原則之一，推拿手法治療疾病時須遵循這一原則，摩腹也不例外?！独逭茨σg》記載：“緩摩為補，急摩為瀉。”強調了手法治病注重“補瀉”原則，而手法的緩急補瀉原則往往體現(xiàn)在手法頻率的高低[14]。本課題組前期研究[15]指出，推拿手法治療疾病存在一定的頻率-效應關系，其中關于摩法治療胃腸疾病時，101～ 150 次/分為最佳的治療頻率段，起到補的良性效應，而頻率201～250 次/分則起到瀉的損益效應。

本研究結果顯示：與模型組比較，低頻摩腹組家兔胃黏膜上皮細胞排列規(guī)則，稍有水腫，胃小彎組織CaM、MLCK 的mRNA 及蛋白表達水平顯著升高，高頻摩腹組家兔胃黏膜上皮細胞大部分柱狀上皮破壞，部分淋巴細胞浸潤，CaM、MLCK的mRNA 表達水平顯著降低，蛋白表達水平顯著降低。同時，與低頻摩腹組比較，高頻摩腹組家兔胃黏膜上皮細胞被破壞，部分淋巴細胞浸潤，MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平顯著降低。經摩腹干預治療后，低頻摩腹組家兔反應較治療前靈敏，毛發(fā)逐漸恢復光澤，體質量、飲食較治療前好轉，大便成形，高頻摩腹組各項指標較治療前均變差。表明低頻率（101～150 次/分）摩腹能促進脾虛家兔消化功能恢復，具有補的良性效應；而高頻率（201～250 次/分）無法促進胃腸消化功能恢復，甚至有一定的破壞性，具有瀉的損益效應。本實驗進一步證實了“緩摩為補，急摩為瀉”的原理[16-18]，同時也體現(xiàn)了手法在治療過程中注重補瀉原則的意義。本研究采用高頻率的摩腹對脾虛家兔進行干預，結果顯示，造模成功后的家兔處于脾虛狀態(tài)，給予高頻率摩腹干預后家兔胃腸消化功能未得到恢復，高頻率摩腹起到了瀉法的作用，甚至有一定的破壞性，驗證了“補瀉反則病益篤”的中醫(yī)治療原則。

另外，本研究結果還顯示，與模型組比較，低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔胃小彎組織CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平顯著降低。理論上分析認為，這2組家兔的胃腸道消化功能會比治療前變差，甚至加重，但實際上低頻摩腹+抑制劑組、高頻摩腹+抑制劑組家兔反應較前靈敏，毛發(fā)逐漸恢復光澤，體質量、飲食較前好轉，大便成形。ML-9 為MLCK 的特異性抑制劑，阻斷CaM-MLCK 信號通路的表達后，摩腹仍能改善脾虛家兔的胃腸道功能，這提示摩腹除了通過CaM-MLCK 信號通路可能作用在其他信號通路或靶點上促使胃腸平滑肌收縮。目前已知調節(jié)胃腸運動的途徑，還包括了KC、PAR-2[19]介導及c-kit/SCF 的信號通路，后續(xù)有待從以上信號通路研究摩腹在MLCK信號通路被抑制情況下仍能發(fā)揮調理胃腸、改善消化功能作用的機制，進一步深究摩腹的作用機制。

綜上所述，摩腹治療脾虛家兔可通過促進CaM-MLCK 信號通路上CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達，引起胃腸平滑肌收縮，促進胃腸動力，進而改善脾虛狀態(tài)。其中：低頻率（101～150次/min）摩腹具有補的效應，可能與上調CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平從而激活CaM-MLCK 信號通路有關；而高頻率（201～ 250 次/ min）摩腹起到瀉的效用，與下調CaM、MLCK 的mRNA 和蛋白表達水平從而抑制CaM-MLCK信號通路有關。