劉 昆 蔣 俊 宋小亞 路新彥 曾凡清 應(yīng)國華

（麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院 浙江 麗水 323000）

香菇（Lentinulaedodes）具有重要的食用和藥用價值，在中國已經(jīng)有800 余年的栽培歷史[1-2]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2021 年我國香菇鮮品總產(chǎn)量近1 300 萬噸，占所有食用菌總產(chǎn)量的31.34%，是我國第一大菇種[3]。隨著栽培規(guī)模與菌種使用年數(shù)的增加，主栽品種在歷經(jīng)數(shù)次傳代、分離、保藏、繁育和運輸后，出現(xiàn)了菌種退化現(xiàn)象，給香菇產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展帶來不良影響。

香菇品種L135（國品認(rèn)菌2007005）為福建省三明市真菌研究所于2007 年篩選育成。為低溫晚熟型品種，菌齡160～200 天，子實體柄短肉厚，菇形圓正，鱗片少，易形成花菇。其菌絲抗逆性較差，抗雜菌能力較弱，不耐高溫，不易越夏，適宜32 ℃以下區(qū)域或海拔較高、氣溫涼爽地區(qū)栽培。浙江省慶元縣、景寧縣等高海拔山區(qū)因夏季涼爽、冬季溫差大，滿足L135 品種特性要求，因而L135曾被菇農(nóng)廣泛栽培。近年來，L135 品種在生產(chǎn)中逐漸表現(xiàn)出爛棒率高，產(chǎn)量低，菇小、畸形等問題，給菇農(nóng)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

為研究香菇L135 品種退化的原因，探索香菇品種退化的內(nèi)在機(jī)理，本文以6 個不同來源的生產(chǎn)用L135 菌株為實驗材料，對其菌絲形態(tài)、漆酶活性、抗高溫能力、栽培產(chǎn)量、子實體特征等進(jìn)行比較分析，期望篩選出遺傳穩(wěn)定、性狀較好與明顯退化的菌株，為進(jìn)一步研究香菇種性退化機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為香菇品種選育提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從麗水各地收集不同來源且栽培中使用的香菇L135 品種菌株，經(jīng)初步篩選后獲得6 株表型差異明顯的菌株，編號分別為：L135-1、L135-18、L135-19、L135-21、L135-29、L135-30。為了確定菌株的真實性，以上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供的L135 菌株為對照，按照國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 1845—2010《食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)》、NY/T 1743—2009《食用菌菌種真實性鑒定 RAPD法》、NY/T 1730—2009《食用菌菌種真實性鑒定ISSR 法》，對6 個菌株進(jìn)行了真實性鑒定，鑒定結(jié)果顯示所有菌株均真實可靠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作

馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（PDA）培養(yǎng)基：購自榮研生物科技（中國）有限公司，按照說明書加熱溶解，于121 ℃滅菌20 min，待溫度降至60 ℃左右時，分裝于直徑90 mm 培養(yǎng)皿中，每皿20 mL。

木屑培養(yǎng)基：培養(yǎng)基配方為雜木屑78%、麥麩20%、紅糖1%、石膏1%，料水比為1∶1.2，pH自然。取木屑培養(yǎng)基45 g 分裝于20 mm×300 mm試管中，使用木棒壓平至固定高度，硅膠塞封口，121 ℃滅菌60 min，冷卻至常溫后備用。

木屑瓊脂培養(yǎng)基：培養(yǎng)基配方為雜木屑（粉碎機(jī)粉碎2 min，10 目過篩）78 g、麥麩20 g、石膏1 g、葡萄糖1 g、瓊脂粉16 g，混合攪拌均勻后，稱取2.90 g 分裝到100 mL 三角瓶，加水25 mL，于121 ℃滅菌30 min，待溫度降至60 ℃左右時，分裝于直徑90 mm 培養(yǎng)皿中，每皿20 mL。

愈創(chuàng)木酚（POD）培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基中加入0.04%愈創(chuàng)木酚，于121 ℃滅菌20 min 滅菌后分裝于90 mm 培養(yǎng)皿中，每皿20 mL[5]。

漆酶活性定量試劑盒：購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 菌株活化

將試驗菌株從試管斜面中接種于PDA 平板中心，于25 ℃下活化培養(yǎng)7 天，使用7 mm 打孔器，在菌落邊緣同步生長菌絲處取菌絲塊，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 菌株性狀檢測

菌絲形態(tài)觀察。將活化菌絲塊分別接種于PDA平板與木屑瓊脂培養(yǎng)基中心，每個菌株3 個重復(fù)，于25 ℃培養(yǎng)30 天，觀察菌絲形態(tài)生長變化情況。

菌絲生長速度測定。將3 塊活化菌絲塊接種于裝有木屑培養(yǎng)基的試管中心，于25 ℃溫度下直立培養(yǎng)，待菌絲生長1 cm 時，劃起始生長線，最快菌株菌絲生長至距試管底部1 cm 時劃終止生長線，測量生長距離，計算日均生長速度。

漆酶活性定性測定。將活化菌絲塊接種于POD平板上，每個菌株3 個重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)8～12 天，每天定時記錄有無紅棕色變色圈的產(chǎn)生及變色圈直徑的大小，記錄變色圈直徑。根據(jù)變色圈的直徑大小，檢測漆酶產(chǎn)生能力。

漆酶活性定量測定。將活化菌絲塊分別接種于鋪有半透膜的木屑培養(yǎng)基平板上，每個菌株3 個重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)15 天，收集菌絲體。于液氮中將菌絲體研磨成粉末狀。按照漆酶活性檢測試盒說明書進(jìn)行漆酶定量測試。

高溫協(xié)迫檢測。將3 塊活化菌絲塊接種于裝有木屑培養(yǎng)基的大試管中，25 ℃培養(yǎng)7～10 天后，劃起始生長線。隨后置于42 ℃高溫處理4 h 后，繼續(xù)25 ℃培養(yǎng)，菌絲距試管底部1 cm 時，劃終止生長線，測量生長距離，計算高溫脅迫處理后菌絲生長速度。

農(nóng)藝性狀檢測。栽培地點位于浙江省麗水市景寧縣包鳳村，在高棚內(nèi)采用常規(guī)層架式栽培出菇管理。栽培料配方為雜木屑79%，麥麩20%，石膏1%，含水量55%～60%，pH 自然。栽培袋規(guī)格為15 cm×55 cm，每袋填裝栽培料1.8 kg，常壓滅菌，開放式接種。每個菌株設(shè)3 個小區(qū)重復(fù)，每重復(fù)36 棒。子實體菌幕裂開但未完全消失時進(jìn)行采摘，統(tǒng)計單棒產(chǎn)量。每個菌株隨機(jī)挑取100 個子實體，測量子實體單菇重，菌蓋直徑、厚度，以及菌柄直徑和長度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

使用R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇L135 不同菌株菌絲形態(tài)

分別接種到PDA 培養(yǎng)基和木屑瓊脂培養(yǎng)基的6 個L135 菌株菌絲形態(tài)差異明顯（圖1）。在PDA培養(yǎng)基中，菌株L135-1、L135-18、L135-19 菌絲較稀疏，無加厚隆起，無原基形成。在木屑瓊脂培養(yǎng)基中，菌株L135-1 菌絲明顯稀疏，L135-18、L135-19 菌絲相對較濃，但無褐色斑點、子實體原基發(fā)生。菌株L135-21、L135-29、L135-30 在兩種培養(yǎng)基均出現(xiàn)菌絲局部加厚隆起、變色及出現(xiàn)子實體原基形態(tài)等現(xiàn)象，與大田栽培中正常菌棒轉(zhuǎn)色前期菌絲隆起現(xiàn)象類似。

圖1 香菇L135 不同菌株在PDA 培養(yǎng)基（上）和木屑瓊脂培養(yǎng)基（下）的菌絲形態(tài)

2.2 香菇L135 不同菌株菌絲生長速度

如表1 所示，在木屑培養(yǎng)基中，6 個菌株菌絲生長速度差異明顯，其中以L135-29、L135-30 較快，分別為7.31 mm/d和7.24 mm/d；L135-21次之；L135-1、L138-18、L135-19 均低于7.0 mm/d，L135-1最慢，僅5.17 mm/d，顯著低于其他菌株。

表1 香菇L135 不同菌株菌絲生長速度

2.3 香菇L135 不同菌株菌絲漆酶活性定性分析

L135 菌株漆酶活性測定結(jié)果表明（表2、圖2），不同菌株之間差異明顯。L135-1 菌株在POD 平板上的菌絲呈絮狀，氧化圈顏色較淺；L135-18、L135-19 菌株在POD 平板中的菌絲致密，氧化圈顏色最深；L135-21、L135-29、L135-30 菌株在POD平板中菌絲量居中，氧化圈顏色較淺。綜合得出6個菌株漆酶活性從高到低依次為：L135-21、L135-30、L135-29、L135-1、L135-18、L135-19。

表2 香菇L135 不同菌株的漆酶活性

圖2 香菇L135 不同菌株在POD 平板培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)

2.4 香菇L135 不同菌株菌絲漆酶活性定量分析

漆酶活性定量分析結(jié)果（表2）表明，6 個菌株之間差異明顯，不同菌株之間的漆酶活性變化趨勢與定性測試結(jié)果相近。菌株L135-30、L135-21、L135-29 漆酶活性仍較高，其余3 個菌株漆酶活性表現(xiàn)較差，其中L135-1 菌株漆酶活性僅為31.37 U/g，遠(yuǎn)低于其他菌株。

2.5 香菇L135 不同菌株抗高溫能力

6 個L135 菌株經(jīng)42 ℃處理4 個小時后，菌絲長勢與生長速度出現(xiàn)明顯的差異（表3、圖3）。在菌絲長勢方面，以菌株L135-21 菌絲表現(xiàn)濃密、潔白，其他5 個菌株呈現(xiàn)出不同程度的菌絲淡化現(xiàn)象。在生長速度方面，菌株L135-21、L135-29、L135-30 較快，3 個菌株間無顯著差異，L135-18、L135-19 菌株次之，L135-1 最慢。表明抗高溫能力菌株L135-21 較強(qiáng)，其余菌株偏弱。

表3 香菇L135 不同菌株高溫脅迫后生長速度

圖3 香菇L135 不同菌株高溫脅迫后菌絲生長情況

2.6 香菇L135 不同菌株子實體形態(tài)

在子實體形態(tài)方面（表4），菌株L135-29 的單菇重、菌蓋直徑和厚度、菌柄長度和直徑均顯著優(yōu)于其他菌株，但其有36%的子實體菌蓋中心會向上明顯伸長，呈典型的尖頂形狀，商品性狀反而較差；L135-21 單菇重等5 個指標(biāo)居次，而子實體尖頂率較低，僅0.94%；L135-1、L135-30 子實體整體均偏小，表現(xiàn)較差。L135-18、L135-19 在越夏過程中菌棒爛棒嚴(yán)重，子實體數(shù)量較少，未能進(jìn)行有效統(tǒng)計分析。

表4 香菇L135 不同菌株子實體形態(tài)特征數(shù)據(jù)

2.7 香菇L135 不同菌株栽培產(chǎn)量

如表5 所示，6 個菌株的子實體產(chǎn)量差異顯著。L135-1、L135-21、L135-29 每棒平均產(chǎn)量均超過280 g，明顯高于另外3 個菌株，3 菌株之間產(chǎn)量差異不顯著。菌棒轉(zhuǎn)色速度，L135-1 明顯慢于其他菌株，且出菇集中于前兩潮，子實體較小，商品價值不高。菌株L135-18、L135-19、L135-30 產(chǎn)量極低，不適合栽培生產(chǎn)。

表5 香菇L135 不同菌株栽培產(chǎn)量

3 結(jié)論與討論

同一品種不同菌株間遺傳背景相近，從中篩選出性狀優(yōu)良與疑退化菌株，更容易以彼此為參照，探索香菇品種退化的內(nèi)在機(jī)理。本研究以麗水當(dāng)?shù)厣a(chǎn)中曾廣泛栽培的L135 品種為試驗對象，共收集30 余份不同來源的菌株，經(jīng)前期栽培篩選，初步獲得6 株表型差異較顯著的菌株。為了驗證這些菌株的遺傳穩(wěn)定性與性狀差異，為后續(xù)研究奠定材料基礎(chǔ)，本文對L135 品種6 個不同表型菌株的菌絲形態(tài)、菌絲生長速度、產(chǎn)漆酶能力、抗高溫能力、子實體形態(tài)、栽培產(chǎn)量等方面進(jìn)行分析。

菌株L135-1 在菌絲形態(tài)、漆酶活性、抗高溫能力等方面均表現(xiàn)較差，但栽培產(chǎn)量較高，與L135-21、L135-29 無顯著差異，且出菇期集中在前2 潮，但子實體較小，栽培效益不高。L135-30 耐高溫能力、產(chǎn)漆酶能力雖然較高，但產(chǎn)量與子實體形態(tài)均較差。L135-18 與L135-19 在各個方面均表現(xiàn)較差，且在越夏過程中菌棒爛棒嚴(yán)重，產(chǎn)量極低。綜合以上結(jié)果，L135-1、L135-18、L135-19、L135-30共4 個菌株初步判定為退化明顯株系，并且可能代表著3 個不同的退化類型，可作為后續(xù)退化機(jī)理研究的代表菌株。

菌株L135-21 的菌絲體形態(tài)正常、漆酶活性高，抗高溫、產(chǎn)量高、子實形態(tài)較好，性狀良好，可作為后續(xù)分析的正常對照菌株。相比 L135-21，L135-29 各性狀也較好，但其尖頂子實體占比較高，商品價值低，菌株整體性狀一般。

在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，6 個L135 菌株在PDA培養(yǎng)基中的生長速度、耐高溫能力與菌絲體形態(tài)、子實體形態(tài)、栽培產(chǎn)量等并沒有較好的對應(yīng)關(guān)系。為了獲得各性狀可相互對應(yīng)的數(shù)據(jù)，本研究中菌絲體形態(tài)、菌絲生長速度、高溫脅迫等實驗均使用了與栽培相近的木屑培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木屑培養(yǎng)基優(yōu)于PDA 培養(yǎng)基，更適合不同菌株之間的相互比較。但木屑瓊脂培養(yǎng)基因顏色較深，對漆酶活性的定性測試有影響，未能在相應(yīng)實驗中使用。

香菇屬于白色木腐菌，在栽培過程對木屑中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素具有明顯的降解作用[6]。漆酶是分解木質(zhì)素的重要酶，對其進(jìn)行檢測可反映香菇菌絲對栽培基質(zhì)的利用能力。除了降解木質(zhì)素作用外，漆酶在色素合成、子實體形成、脫毒等方面都扮演了重要的角色[7]。漆酶對香菇生長有著重要作用，本研究中部分菌株的菌絲產(chǎn)漆酶能力與菌絲形態(tài)、栽培產(chǎn)量、子實體形態(tài)、抗高溫能力等指標(biāo)也有一定的相關(guān)性。但香菇菌絲中的其他氧化酶可能也會對愈創(chuàng)木酚進(jìn)行氧化[7]，造成定性測試與定量測試有一定的誤差，后續(xù)還需要對漆酶定性試驗進(jìn)行改進(jìn)，提升其準(zhǔn)確性。