沈維亞，吳朝文

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AT）是一種常見的甲狀腺疾病，多發(fā)于中年女性，主要是由淋巴細胞浸潤且伴有自身抗體形成，導致患者的甲狀腺腫大、功能出現(xiàn)異常［1-2］。目前臨床患者癥狀較輕且治療AT 的藥物較少［3-4］，因此尋求一種治療AT 的藥物對臨床有著重要意義。蘆薈屬于百合科植物［5-6］，含有豐富的糖類、氨基酸、各種有機酸及蒽醌類化合物。其中蘆薈多糖占蘆薈凝膠的60%左右，其化學結構為線性的β-（1，4）-D 甘露糖作為基本單元組成的長鏈聚合物。研究顯示［7］，蘆薈多糖具有抗腫瘤、抗輻射、抗菌消炎及抗燙傷等功效，還具有降低血糖及免疫調節(jié)等藥理作用。有研究顯示［8-9］，蘆薈多糖對機體免疫系統(tǒng)功能有全面的調節(jié)作用，可促進T、B 淋巴細胞的分化和增殖，同時增加T 細胞的細胞毒性，并提高巨噬細胞內乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶、精氨酸酶活性，進而促進機體腫瘤壞死因子α 及白細胞介素1 等的釋放。本研究將對AT 小鼠模型進行蘆薈多糖的治療，旨在分析蘆薈多糖對AT 小鼠的甲狀腺功能及輔助型T 細胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

將50 只健康無特定病原體的BALB/C 雌性小鼠（廣州市謹為生物科技有限公司，NIH 小鼠，動物批號：JW019）隨機分為蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對照組，每組各10 只，所有小鼠均為6～8 個月，體重在16～18 g。其中對照組小鼠均為健康小鼠，AT 組及蘆薈多糖低、中、高劑量組均為AT 小鼠，蘆薈多糖低、中、高劑量組采取藥物治療。本次小鼠研究均經過深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院動物倫理委員會批準（批準編號：GDY1902240）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 使用豬甲狀腺球蛋白免疫聯(lián)合高碘水法建立小鼠AT 模型，主要方法如下：將豬甲狀腺球蛋白（porcine thyroglobulin， pTg）與等量體積完全弗氏佐劑制成終濃度為0.25 mg/ml 的油包水乳劑，并按50 μg/只，于小鼠背部皮下多點注射，1 次/周，連續(xù)2 周。第3 周后按50 μg/只，于背部皮下多點注射不完全弗氏佐劑與pTg 等體積制成終濃度為0.25 mg/ml 的油包水乳劑，1 次/周，連續(xù)3 周，同時每天飲用高碘水（劑量：0.63 mg/ml NaI），建立小鼠AT 模型。

1.2.2 蘆薈多糖提取 取新鮮蘆薈葉切成10 mm厚，干燥箱烘干（50 ℃，48 h）。粉碎機粉碎干燥的蘆薈片，制成蘆薈細粉，將蘆薈細粉置于黑色或棕色瓶中密封保存?zhèn)溆?。蘆薈多糖主要提取工藝如下：蘆薈細粉按料液比為1∶20（g/ml）復水，超聲處理（中國西門子有限公司SSA-770A，功率：800 W，時間：9 min），離心機離心［美國貝克曼勒特 OPTIMA XE-90，9 000 r/min（離心半徑為8 cm）15 min］，過濾，取濾液。使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮處理（0.08 MPa，60 ℃），濃縮至濃稠狀，再按體積比1∶4 加入無水乙醇，靜置過夜（4 ℃），離心10 min［2 500 r/min（離心半徑為8 cm）］，取沉淀物，即為蘆薈多糖。

1.2.3 治療方法 蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠分 別 灌 胃 給 藥150 mg·kg-1·d-1、300 mg·kg-1·d-1、600 mg·kg-1·d-1，而AT 組及對照組給予等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)治療4 周。

1.2.4 檢測方法 5 組治療4 周后麻醉小鼠，并對小鼠采用脊椎脫臼處理法處死，收集小鼠外周血，依據(jù)體重不同采集其體重的1%～3%，在0.2～0.6 ml，并置于室溫下6 h，然后采用醫(yī)用離心機，以3 000 r/min（離心半徑為8 cm）離心20 min，取上清液。采用化學發(fā)光法檢測所有血清樣本的促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone， TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine， FT3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（free tetraiodothyronine， FT4）。依據(jù)試劑盒的說明書進行檢測。試劑盒購自上海艾博生物科技有限公司（B11689-Hu）。

對于輔助T 淋巴細胞亞群，需取小鼠的外周血和脾臟組織，并分離外周血單個核細胞和脾細胞懸液。室溫孵育半小時后采用流式細胞儀檢測CD3+CD8+IL-4+（白細胞介素-4， interleukin-4）輔助T 淋巴細胞和CD3+CD8+IFN-γ+（干擾素，interferon）頻率，試劑盒購自上海艾博生物科技有限公司（CB10096-Hu）。

1.3 觀察指標

（1）比較蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對照組小鼠的甲狀腺功能指標水平：TSH、FT3 及FT4；（2）比較5 組小鼠外周血CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞和CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平；（3）比較5 組小鼠脾臟組織CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞和CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用F檢驗，2 組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)表示。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的甲狀腺功能指標比較

在蘆薈多糖治療4 周后，蘆薈多糖低、中、高劑量組及AT 組小鼠的TSH 水平比對照組高，而FT3、FT4 水平較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。蘆薈多糖低、中、高劑量組較AT 組TSH 水平降低，而FT3、FT4 水平升高（P＜0.05）。見表1。

表1 蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對照組小鼠的甲狀腺功能指標（每組n=10）

2.2 各組小鼠外周血的輔助型T 淋巴細胞頻率比較

在蘆薈多糖治療4 周后，與對照組比較，AT組、蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠外周血的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與AT 組比較，蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠外周血CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對照組小鼠外周血的輔助型T 淋巴細胞頻率比較（%，每組n=10）

2.3 各組小鼠脾臟輔助型T 淋巴細胞頻率比較

在蘆薈多糖治療4 周后，與對照組比較，AT組、蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠脾臟組織的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與AT 組比較，蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠脾臟組織的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平降低（P＜0.05）。見表3。

表3 蘆薈多糖低、中、高劑量組、AT 組、對照組小鼠脾臟輔助型T 淋巴細胞頻率比較（%，每組n=10）

3 討論

AT 又稱為淋巴性甲狀腺炎，目前臨床研究表明環(huán)境因素及遺傳因素是導致AT 發(fā)病的主要原因，但其發(fā)病機制暫不明確［10］。相關文獻顯示［11-12］，目前我國有超過2 億的甲狀腺疾病患者，AT 患病率占總人群的1%～2%，AT 發(fā)病機制復雜，且缺乏有效的治療方法和藥物。本研究通過采取豬甲狀腺球蛋白聯(lián)合過量碘誘導產生AT 小鼠模型。本研究采用蘆薈多糖分高、中、低劑量3 組小鼠進行4 周的連續(xù)治療，并采用生理鹽水同期灌喂AT 組及對照組，在甲狀腺功能檢測及輔助型T 細胞亞群檢測中發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖高、中、低組較AT 組血清TSH、FT3、FT4 均有明顯改善，且蘆薈多糖高、中、低組的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平較AT 組也有明顯降低。

多種報道顯示［13-14］，蘆薈多糖主要由半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖及甘露糖組成，除抗燙傷、抗輻射等外，目前還發(fā)現(xiàn)可保肝、降糖及抗突變、艾滋病防治等新的藥理作用。國內學者表明［15］蘆薈多糖可通過調整Th1/Th2 細胞因子的水平而達到調節(jié)機體的免疫抑制作用。機體內，輔助型T 淋巴細胞主要分為Th1、Th2、Th17、Thαβ 輔助細胞，臨床資料表明［16-17］，Th1 輔助細胞主要參與細菌及原蟲的免疫反應，由IL-12 驅動，而Th2 輔助細胞主要為對抗細胞外的細胞寄生蟲的免疫反應，由IL-4 驅動。輔助T 淋巴細胞分化主要受機體的細胞因子的種類及水平所調控，且不同的T 細胞類型也會反過來影響其他細胞因子的分泌。本研究中蘆薈多糖可降低AT 小鼠的TSH 水平，同時升高FT3、FT4 的水平，且隨著蘆薈多糖的劑量增加，改善越明顯，說明蘆薈多糖可明顯改善小鼠的甲狀腺功能，緩解其癥狀。同時進一步分析小鼠外周血及脾臟組織時，發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖可明顯降低AT 小鼠的CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平，且隨著蘆薈多糖的劑量增加外周血及脾臟組織的 CD3+CD8+IL - 4+輔助 T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平下調越多，表明蘆薈多糖可通過調控CD3+CD8+IL-4+輔助T 淋巴細胞及CD3+CD8+IFN-γ+輔助T 淋巴細胞水平進而降低IL-4 和IFN-γ 的分泌，緩解小鼠自身免疫反應。

CD3 是T 淋巴細胞的表面標記物，CD4 和CD8則是T 淋巴細胞的亞群。CD4+T 淋巴細胞被稱為輔助性T 淋巴細胞，可以識別和激活其他免疫細胞來對抗感染和腫瘤。而CD8+T 淋巴細胞被稱為細胞毒性T 細胞，可以直接殺死感染細胞和腫瘤細胞。IL-2R 是細胞因子IL-2 的受體，在T 細胞激活和增殖過程中起到重要作用。在甲狀腺炎的早期，CD4+T 淋巴細胞和IL-2R 的水平通常升高，而CD8+T 淋巴細胞的水平相對較低。這反映了體內的免疫應答正在發(fā)生，而CD4+T 淋巴細胞在這個過程中扮演了重要角色。在疾病進一步發(fā)展時，CD8+T 淋巴細胞的活性可能會增強，同時CD4+T淋巴細胞的水平可能會下降。這反映了體內炎癥反應的進一步加重和對甲狀腺組織的破壞。蘆薈多糖可能通過不同機制調節(jié)這些免疫指標的表達，從而影響AT 小鼠的免疫反應。研究表明［18］，蘆薈多糖可能通過減少炎癥介質的釋放，降低CD4+T 淋巴細胞的活性，并促進CD8+T 淋巴細胞的活性，從而減少對甲狀腺組織的破壞。

綜上所述，在過量碘及豬甲狀腺球蛋白聯(lián)合誘導下建立的AT 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)蘆薈多糖可有效改善AT 小鼠的甲狀腺功能，同時降低輔助型T 細胞亞群水平以抑制AT 小鼠機體內的免疫反應。需要指出的是本研究僅對動物模型進行相關研究，受客觀條件約束未對具體的分子機制進行研究，后續(xù)應開展多中心研究，為AT 的治療提供更有效的實驗數(shù)據(jù)。