朱鑫鑫，朱振宇，王紅月，石 敏，王盼琳，沈昕元，崔云松，金 添，陳飛飛，許建和，鄭高偉

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

手性胺廣泛存在于各種藥物、天然產(chǎn)物和精細(xì)化學(xué)品中(圖1)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的小分子藥物中約有40%含有手性胺的結(jié)構(gòu)砌塊。鑒于酶催化劑在不對(duì)稱合成中近乎完美的立體選擇性。故而亟待開發(fā)出一種高效綠色的酶催化劑用于手性胺的合成。

圖1 含有手性胺結(jié)構(gòu)的藥物分子Fig.1 Pharmaceuticals contain a chiral amine moiety

生物體內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的代謝途徑中含有各種各樣的氧化還原酶，其中包括可以催化亞胺還原反應(yīng)的酶類。如，二氫葉酸還原酶(DHFR)，其在葉酸的代謝途徑中可以將二氫葉酸還原成四氫葉酸(圖2)[1]，后者作為一碳基團(tuán)的載體參與到嘧啶與嘌呤的合成，進(jìn)而進(jìn)一步合成核酸。這種能夠催化亞胺還原的酶對(duì)于生物的正常代謝活動(dòng)至關(guān)重要。然而，這些可以催化亞胺還原的氧化還原酶，雖能高效催化相應(yīng)的天然底物，但由于其功能上的高度專一性，導(dǎo)致其所能催化的底物范圍十分有限，難以催化非天然的亞胺底物。

圖2 二氫葉酸還原酶催化二氫葉酸還原生成四氫葉酸的反應(yīng)[1]Fig.2 Reduction of dihydrofolic acid to tetrahydrogen folic acid by dihydrofolate reductase[1]

2010年，日本的Mitsukura等[2]以2-甲基-1-吡咯啉作為模式底物，篩選到2種具有亞胺還原功能的鏈霉菌，其中，來自Streptomycessp.GF3587 的亞胺還原酶(RIR)可以催化底物生成(R)-2-甲基吡咯烷，而來自Streptomycessp.GF3546的亞胺還原酶(SIR)可以催化底物生成(S)-2-甲基吡咯烷(圖3)，兩種產(chǎn)物的光學(xué)純度——對(duì)映體過量值(e.e.值)分別為99.2%和92.3%。Mitsukura等[3]將RIR純化表征后發(fā)現(xiàn)，RIR具有嚴(yán)格的底物特異性，只能催化2-甲基-1-吡咯啉。而相對(duì)來說，SIR具有更寬泛的底物譜，不僅可催化2-甲基-1-吡咯啉化合物，還能催化1-甲基-3,4-二氫異喹啉和6,7-二甲氧基-1-甲基-3,4-二氫異喹啉等環(huán)狀亞胺[4]。亞胺還原酶RIR和SIR的發(fā)現(xiàn)，不僅推動(dòng)了該類酶在亞胺還原領(lǐng)域的迅速發(fā)展，而且還不斷拓展和豐富了其催化的底物譜和反應(yīng)類型。

圖3 亞胺還原酶SIR和RIR催化的2-甲基-1-吡咯啉的不對(duì)稱還原[2]Fig.3 Asymmetric reduction of 2-methyl-1-pyrroline by imine reductases SIR and RIR[2]

1 亞胺還原酶催化的亞胺還原

2013年，Leipold等[5]發(fā)現(xiàn)，來自Streptomycessp.GF3546的亞胺還原酶SIR具有更廣的底物譜，可以高效不對(duì)稱還原五元、六元和七元環(huán)狀亞胺；除此以外，SIR還可以還原亞胺離子和一些大位阻亞胺，如二氫-β-咔啉和二氫異喹啉類底物(圖4)。

圖4 亞胺還原酶催化的亞胺底物譜[5]Fig.4 The substrate scopes of imine reductases[5]

2015年，筆者所在課題組的Li等[6-7]篩選到一株乳酸菌Paenibacillus lactis來源的亞胺還原酶PlSIR(圖4)，可以高效不對(duì)稱還原3H-吲哚及其衍生物，且e.e.值大于99%。隨后，Li等[8]又篩選到對(duì)四氫異喹啉類底物具有較高催化活性的亞胺還原酶SnIR(來源于Stackebrandita nassauensis)(圖4)，其可催化四氫異喹啉類底物為S構(gòu)型的產(chǎn)物，底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的e.e.值均大于99%。近期，Zhang等[9]篩選獲得了能夠催化2-芳基吡咯啉底物的天然亞胺還原酶。針對(duì)天然亞胺還原酶催化2-芳基吡咯啉類化合物活性較低的問題，Chen等[10]通過定向進(jìn)化與反應(yīng)過程強(qiáng)化成功實(shí)現(xiàn)了廣譜抗腫瘤藥物拉羅替尼(larotrectinib)中間體的工業(yè)化生產(chǎn)，時(shí)空產(chǎn)率高達(dá)352 g/(L·d),e.e.值>99.5%，轉(zhuǎn)化率>99%(圖5)，這證實(shí)了亞胺還原酶在亞胺還原合成中的應(yīng)用潛力。

圖5 工程化亞胺還原酶ScIRED催化合成拉羅替尼手性中間體[10]Fig.5 Production of the chiral larotrectinib intermediate using engineered ScIRED[10]

Wetzl等[11]以不同的單環(huán)、雙環(huán)脂肪族亞胺以及具有苯基官能團(tuán)的芳香族底物為模式底物，表征15個(gè)候選亞胺還原酶的催化能力，進(jìn)一步拓寬亞胺還原酶環(huán)狀亞胺底物譜。2016年，Aleku等[12]鑒定了一種擬無枝酸菌屬Amycolatopsis orientalis來源的亞胺還原酶AoIRED (imine reductase,IRED)，其可以催化合成2-取代吡咯烷、2-取代哌啶、2-取代環(huán)己亞胺和1-甲基四氫異喹啉化合物(圖6)。

圖6 亞胺還原酶AoIRED催化的亞胺還原[12]Fig.6 Biocatalytic reduction of imines by AoIRED[12]

2017年，Qu等[13]利用1-芳基-二氫異喹啉化合物作為篩選底物，獲得了一系列對(duì)大位阻二氫異喹啉類化合物具有優(yōu)良催化效率和立體選擇性的亞胺還原酶(圖7)，其中IR45保持嚴(yán)格的S構(gòu)型偏好性，通過對(duì)其結(jié)構(gòu)的觀察后發(fā)現(xiàn)，IR45的W191位點(diǎn)對(duì)空間位阻影響較大，當(dāng)將191位突變?yōu)檩^小的丙氨酸后，使得底物抑制效應(yīng)解除，催化效率提高8倍。2020年，該課題組的Yang等[14]通過理性設(shè)計(jì)成功篩選得到2個(gè)催化活性較野生型提升的亞胺還原酶突變體，對(duì)于大位阻的1-芳基-6,7-二甲氧基-二氫異喹啉可實(shí)現(xiàn)高立體選擇性地完全轉(zhuǎn)化。

圖7 亞胺還原酶催化的1-芳基取代四氫異喹啉化合物合成[13]Fig.7 Synthesis of 1-aryl-substituted tetrahydro-isoquinolines by imine reductases[13]

2019年，Zumbr?gel等[15]利用亞胺還原酶，在溫和的條件下，實(shí)現(xiàn)10 g/L 2H-1,4-苯并惡嗪的不對(duì)稱還原，e.e.值>99%，分離得率達(dá)71%。同年，Zumbr?gel等[16]用亞胺還原酶催化獲得化學(xué)方法難以制備的2-取代-3-噻唑烷類外消旋化合物，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)96%。Yao等[17]經(jīng)過對(duì)48個(gè)亞胺還原酶的篩選后發(fā)現(xiàn)，來自Sandarearacinus amylolyticus的亞胺還原酶IR40對(duì)大位阻底物的耐受性較好，可催化多種1-芐基六氫異喹啉底物生成相應(yīng)的1-芐基八氫異喹啉衍生物(圖8)。

圖8 亞胺還原酶催化的環(huán)狀亞胺不對(duì)稱還原[17]Fig.8 Asymmetric reduction of cyclicimines by imine reductases[17]

2 亞胺還原酶催化的酮還原胺化

2014年，Müller課題組的Huber等[18]首次發(fā)現(xiàn)來自Streptomycessp.GF3546的亞胺還原酶能夠催化酮與甲胺發(fā)生還原胺化反應(yīng)，盡管底物的轉(zhuǎn)化率只有8.8%(圖9)，但該功能的發(fā)現(xiàn)極大地拓寬了亞胺還原酶的應(yīng)用范圍。隨后，Wetzl等[19]通過篩選獲得了能夠催化酮還原胺化的2種亞胺還原酶，以此實(shí)現(xiàn)(1S,3R)-3-二甲基環(huán)己胺和(R)-N-甲基-2-氨基己烷的制備，具有良好得率(71%、55%)及優(yōu)異的選擇性(非對(duì)映體過量值(d.e.值)為98%、e.e.值為96%)。

圖9 亞胺還原酶催化的酮與甲胺之間的還原胺化反應(yīng)[18]Fig.9 Reductive amination of ketone and methylamine by imine reductase[18]

2017年，Aleku等[20]通過序列比對(duì)，獲得了一個(gè)來自米曲霉的酶催化劑(AspRedAm)，通過4組羰基底物與三組胺供體之間的還原胺化反應(yīng)測(cè)定，證實(shí)了該酶的還原胺化功能及廣泛的底物譜，并將其命名為還原胺化酶(圖10)。隨后2021年該課題組的Marshall等[21]又通過宏基因組挖掘策略鑒定了384種亞胺還原酶，并開發(fā)了一種快速簡(jiǎn)單的顯色高通量篩選方法來鑒定具有酮還原胺化能力的亞胺還原酶。該篩選方法不僅可鑒定催化位阻較大酮的亞胺還原酶，還能鑒定耐熱型亞胺還原酶，這項(xiàng)工作極大地?cái)U(kuò)展了亞胺還原酶的應(yīng)用范圍。

圖10 還原亞胺酶AspRedAm催化的還原胺化反應(yīng)[20]Fig.10 Reductive amination of ketones and amines catalyzed by AspRedAm[20]

由于亞胺還原酶在酮還原胺化研究中的重大突破，人們開始探索其在工業(yè)應(yīng)用中的可行性。葛蘭素史克公司的Schober等[22]利用亞胺還原酶催化的不對(duì)稱還原胺化來合成LSD1抑制劑GSK2879552(圖11)，對(duì)天然亞胺還原酶進(jìn)行3輪進(jìn)化，獲得了一個(gè)具有13個(gè)突變位點(diǎn)的最優(yōu)變體，轉(zhuǎn)化數(shù)(TON)比野生型提高了38 000倍；在pH 4.6的緩沖介質(zhì)中反應(yīng)，底物醛上載量達(dá)16.6 g/L，催化劑用量?jī)H為1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，底物轉(zhuǎn)化率為91.4%，產(chǎn)物分離收率達(dá)到72.2%，e.e.值為99.7%；隨后，在20 L規(guī)模的制備反應(yīng)中，產(chǎn)物分離收率提升到84.4%，純度大于99.9%，e.e.值高達(dá)99.7%，首次實(shí)現(xiàn)了亞胺還原酶在制藥中的應(yīng)用。

圖11 亞胺還原酶催化合成賴氨酸特異性去甲基化酶-1抑制劑GSK2879552[22] Fig.11 Synthesis of lysine-specific demethylase-1 inhibitor GSK2879552 by imine reductase[22]

2021年，輝瑞公司的Kumar等[23]利用亞胺還原酶催化的環(huán)酮和甲胺還原胺化合成藥物abrocitinib中間體(圖12)：通過計(jì)算和生物信息學(xué)相結(jié)合的方式對(duì)天然亞胺還原酶進(jìn)行3輪酶工程改造，獲得的最優(yōu)突變體SpRedAm-R3-V6 (N131H/A170C/F180M/G217D)，它的催化性能比天然酶的提升206倍；在百千克規(guī)模的試驗(yàn)中，反應(yīng)48 h底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)92.5%，產(chǎn)物分離收率達(dá)到73%，時(shí)空產(chǎn)率為60 g/(L·d)，純度大于99.5%、兩個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體的比(d.r.值)大于99∶1，TON高達(dá)36 538，從而實(shí)現(xiàn)了JAK1抑制劑abrocitinib關(guān)鍵中間體的商業(yè)化生產(chǎn)。

圖12 亞胺還原酶突變體催化生產(chǎn)abrocitinib中間體[23]Fig.12 Synthesis of abrocitinib intermediate using engineered imine reductase[23]

隨后，Yao等[24]利用宏基因組策略獲得的亞胺還原酶催化脂肪族和芳香族α-酮酯的還原胺化反應(yīng)，合成N-取代α-氨基酸酯(圖13)：以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯與炔丙胺作為模式底物，對(duì)宏基因組文庫鑒定出的384種亞胺還原酶進(jìn)行了篩選后發(fā)現(xiàn)，有99種亞胺還原酶對(duì)酮酯類化合物具有催化活性，其中78種亞胺還原酶生成R構(gòu)型產(chǎn)物，其他20種亞胺還原酶生成S構(gòu)型產(chǎn)物；對(duì)其中催化活性較好的12種亞胺還原酶，進(jìn)行了多種脂肪族和芳香族α-酮酯與不同有機(jī)胺供體之間還原胺化活性的測(cè)定；利用不同選擇性的亞胺還原酶催化制備了不同構(gòu)型的N-取代α-氨基酸酯，轉(zhuǎn)化率為53%～99%，分離收率達(dá)27%～80%，其中R-選擇性的亞胺還原酶催化產(chǎn)物的e.e.值為98%～99%，S-選擇性亞胺還原酶催化產(chǎn)物的e.e.值為26%～99%。

圖13 亞胺還原酶催化還原胺化不對(duì)稱合成N-取代α-氨基酸酯[24]Fig.13 Asymmetric synthesis of N-substituted α-amino esters by imine reductase-catalyzed reductive amination[24]

2022年，Thorpe等[25]從鑒定的宏基因組亞胺還原酶庫中，篩選出了44種具有雙催化功能的亞胺還原酶(EneIRED)，它們不僅能夠催化羰基的還原胺化，而且能夠催化C=C雙鍵的還原(圖14)。多功能酶EneIRED的發(fā)現(xiàn)，為多手性胺化合物的合成提供一條更簡(jiǎn)單、高效、綠色的路線。

圖14 多功能亞胺還原酶催化的烯烴還原與羰基還原胺化偶聯(lián)反應(yīng)[25]Fig.14 Multifunctional biocatalyst EneIRED for conjugate reduction and reductive amination[25]

手性氮雜環(huán)化合物是許多手性藥物的重要中間體，如治療糖尿病藥物利拉利汀(linagliptin)和阿洛列汀(alogliptin)、治療淋巴瘤藥物依魯替尼(ibrutinib)以及治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物托法替尼(tofacitinib)等[26-29]。Zhang等[30]利用亞胺還原酶催化氮雜環(huán)酮與有機(jī)胺供體合成烷基化手性氮雜環(huán)化合物(圖15)：以N-Boc-3-哌啶酮和芐胺為模式底物，從86 種IRED酶庫中篩選出9種具有催化活性的酶催化劑；針對(duì)天然酶IR-G36催化效率極低和立體選擇性不足的問題，對(duì)酶進(jìn)行分子改造，獲得了催化效率比母本提高了4 193倍的最優(yōu)突變體M5 (kcat/Km為3.350 L/(mmol·min))，同時(shí)也顯著提高了該酶的熱穩(wěn)定性(Tm值提高16.2 ℃)；對(duì)模式底物的克級(jí)制備反應(yīng)中，當(dāng)?shù)孜锿度肓繛?4.9 g/L時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá)到97%、時(shí)空產(chǎn)率高達(dá)35.3 g/(L·d)。利用該突變體，實(shí)現(xiàn)了不同氮雜環(huán)酮與多種有機(jī)胺供體的直接還原胺化制備反應(yīng)。

圖15 亞胺還原酶催化氮雜環(huán)酮的還原胺化反應(yīng)[30]Fig.15 Asymmetric synthesis of azacycloalkyl amines via imine reductase-catalyzed reductive amination[30]

Chen等[31]發(fā)現(xiàn)，青霉菌Penicillium camemberti來源的亞胺還原酶PcIRED能實(shí)現(xiàn)羰基底物與大位阻胺之間的還原胺化反應(yīng)，但是天然酶PcIRED催化模式底物3-(3-三氟甲基苯基)丙醛與(R)-1-(1-萘基)乙胺還原胺化合成藥物西那卡塞(cinacalcet)的轉(zhuǎn)化率僅為0.63%，隨后他們對(duì)該酶進(jìn)行了分子改造，通過3輪突變，顯著提高了該酶的催化效率，最優(yōu)突變體PcIRED-M3的比酶活為8.14 U/mg，比野生型提高了488倍；同時(shí)該酶的熱穩(wěn)定性也顯著提升，其Tm值為51.5 ℃，比野生型提高了10 ℃；利用最優(yōu)突變體PcIRED-M3，實(shí)現(xiàn)了西那卡塞的克級(jí)規(guī)模制備，底物轉(zhuǎn)化率為93%，e.e.值為99%，產(chǎn)物分離得率高達(dá) 85% (圖16)。最后，還利用突變體與野生酶分別研究不同羰基底物與大位阻胺供體之間的還原胺化反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，突變體能夠?qū)崿F(xiàn)多種大位阻胺類藥物分子或藥物前體的酶促合成。如，鈣敏受體激動(dòng)劑替卡塞(tecalcet)[32]、滅蟲劑芐酚寧(bephenium)藥物前體[33]、α-腎上腺素受體拮抗劑酚芐明(phenoxybenzamine)藥物前體[34]、5-HT1A受體拮抗劑阿爾維林(alverine) 藥物前體[35]以及抗真菌萘替芬(naftifine) 藥物前體[36]。

圖16 PcIRED-M3催化的西那卡塞合成反應(yīng)[31]Fig.16 Preparative synthesis of cinacalcet catalyzed by PcIRED-M3[31]

3 涉及亞胺還原酶催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)

多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)在生物和化學(xué)合成方面受到越來越多的關(guān)注，這是因?yàn)槎嗝讣?jí)聯(lián)反應(yīng)無須基團(tuán)的保護(hù)和脫保護(hù)，不需要苛刻的反應(yīng)條件，可以產(chǎn)生化學(xué)方法難以獲得的高官能團(tuán)和高光學(xué)純度的手性分子。在以前研究工作[37-38]中，利用IRED對(duì)亞胺中間體的選擇性還原取代了胺氧化酶和非選擇性化學(xué)還原劑級(jí)聯(lián)，通過級(jí)聯(lián)葡萄糖脫氫酶，額外添加葡萄糖就可以使得NADPH輔酶再生?；贗REDs的多酶級(jí)聯(lián)體系開發(fā)為取代的N-雜環(huán)吡咯烷和哌啶提供了有效的生物合成途徑。這些手性取代的五元和六元N-雜環(huán)化合物存在于生物活性產(chǎn)物和藥物分子中。

Heath等[39]構(gòu)建了6-羥基-D-尼古丁氧化酶(6-HDNO)與IRED級(jí)聯(lián)的多酶催化體系，實(shí)現(xiàn)了N-雜環(huán)化合物的去外消旋化(圖17)：先利用6-HDNO突變體將外消旋吡咯烷和哌啶的一個(gè)對(duì)映體去消旋化，生成相應(yīng)的亞胺中間體，隨后利用S選擇性的IRED進(jìn)行不對(duì)稱還原，生成單一構(gòu)型的手性胺化合物，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到71%～99%。

圖17 亞胺還原酶和胺氧化酶級(jí)聯(lián)催化N-雜環(huán)的去消旋化[39]Fig.17 Deracemization of nitrogen heterocycles by imine reductase and amine oxidase[39]

France等[40]和Hepworth等[41]通過羧酸還原酶(CAR)、ω-轉(zhuǎn)氨酶(ω-TA)和IRED的級(jí)聯(lián)(圖18)，實(shí)現(xiàn)了從酮酸或酮醛到手性單取代和雙取代哌啶和吡咯烷的生物催化合成：首先來自海洋分枝桿菌的CAR，將酮酸還原為酮醛；然后，再利用轉(zhuǎn)氨酶ATA-113催化醛胺化生成氨基酮，并自發(fā)環(huán)化形成環(huán)狀亞胺化合物；最后，形成的亞胺分別被立體選擇性互補(bǔ)的IRED進(jìn)行不對(duì)稱還原，獲得兩種對(duì)映異構(gòu)體的胺產(chǎn)物。該系統(tǒng)還構(gòu)建了輔因子自循環(huán)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了輔因子的自給自足，通過體內(nèi)外級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成了系列高立體選擇性(e.e.值和d.e.值都大于98%)的單取代/雙取代哌啶和吡咯烷。

圖18 羧酸還原酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶和亞胺還原酶一鍋法級(jí)聯(lián)合成哌啶和吡咯烷[40-41]Fig.18 One-pot cascade synthesis of piperidines and pyrrolidines using carboxylic acid reductase,ω-transaminase and imine reductase[40-41]

Slabu等[42]構(gòu)建了大腸桿菌K12來源的腐胺轉(zhuǎn)氨酶pATAs與IRED級(jí)聯(lián)的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了從鏈狀二胺到氮雜環(huán)化合物的合成(圖19)：首先利用腐胺轉(zhuǎn)氨酶與氨基酸氧化酶級(jí)聯(lián)將腐胺和尸胺的其中一個(gè)胺基轉(zhuǎn)化為醛基，醛基胺中間體經(jīng)自發(fā)環(huán)化形成1-吡咯啉或1-哌啶；然后，經(jīng)IRED催化的立體選擇性還原生成相應(yīng)的吡咯烷和哌啶產(chǎn)物，該途徑可以實(shí)現(xiàn)99%的底物轉(zhuǎn)化率。

圖19 腐胺轉(zhuǎn)氨酶和亞胺還原酶級(jí)聯(lián)催化二胺生成飽和N-雜環(huán)化合物[42]Fig.19 Synthesis of saturated nitrogen heterocycles from diamines using putrescine transaminases and imine reductase[42]

在此基礎(chǔ)上，Borlinghaus等[43]對(duì)此級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，利用工程化的腐胺氧化酶(PuO)和IRED進(jìn)行級(jí)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了從二胺到N-雜環(huán)吡咯烷和哌啶的合成(圖20)：首先，對(duì)來自紅串紅球菌的腐胺氧化酶進(jìn)行工程改造，并利用工程化的腐胺氧化酶對(duì)取代的二胺進(jìn)行選擇性氧化；然后，通過IREDs催化的亞胺中間體不對(duì)稱還原，形成相應(yīng)的N-雜環(huán)化合物。通過該雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)從1,5-二氨基-2-甲基戊烷到3-甲基哌啶的高效合成。

圖20 腐胺氧化酶和亞胺還原酶全細(xì)胞級(jí)聯(lián)催化制備3-甲基哌啶[43]Fig.20 Putrescine oxidase and imine reductase cascade biotransformation to access 3-methylpiperidine in whole cells[43]

Thorpe等[44]構(gòu)建了烯烴還原酶(ERED)與IRED級(jí)聯(lián)的多酶催化體系，首先通過催化ERED烯胺(α,β-不飽和亞胺)中 C=C鍵還原，然后再通過IRED介導(dǎo)的C=N還原，制備非對(duì)映異構(gòu)富集的2-取代飽和N-雜環(huán)(圖21)。利用該途徑，對(duì)手性胺(S)-2-(1 -甲基乙基)哌啶和(RS)-2-仲丁基哌啶進(jìn)行了制備合成，得到具有優(yōu)異對(duì)映選擇性(e.e.值>99%)的鹽酸鹽產(chǎn)物。

圖21 烯烴還原酶和亞胺還原酶一鍋級(jí)聯(lián)催化還原環(huán)亞胺制備飽和N-雜環(huán)化合物[44]Fig.21 One-pot biocatalytic cascade reduction of cyclic enimines to N-heterocycles by olefin reductase and imine reductase[44]

隨后，Harawa等[45]構(gòu)建了化學(xué)催化與生物催化級(jí)聯(lián)的化學(xué)-酶法合成體系，使用非對(duì)映選擇性的一鍋胺氧化酶/烯亞胺還原酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將N-取代的四氫吡啶(THPs)轉(zhuǎn)化為手性的3-和3,4-取代的哌啶(圖22)：使用NaBH4作為氫化物源，催化活化的吡啶生成相應(yīng)的THPS，通過級(jí)聯(lián)胺氧化酶(AmOx)原位催化氧化THP生成相應(yīng)的二氫吡啶(DHPs)，產(chǎn)生與C=N鍵偶聯(lián)的活化C=C鍵，然后被雙功能酶EneIREDs還原，生成3-和3,4-取代哌啶。

圖22 胺氧化酶和亞胺還原酶級(jí)聯(lián)催化合成手性哌啶[45]Fig.22 Synthesis of chiral piperidine by amine oxidase and imine reductase[45]

Mattey等[46]采用多點(diǎn)注射反應(yīng)器(MPIR)開發(fā)了一種連續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)(圖23)，并使用工程化膽堿氧化酶 AcCO6生成醛來測(cè)試MPIR的可行性；再將固定化轉(zhuǎn)氨酶BmTA后裝入填充床后連接到MPIR的輸出端產(chǎn)生MPIR填充床系統(tǒng)(MPBS)，實(shí)現(xiàn)伯胺2的高效合成。同樣，利用AdRedAm與BsGDH級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了仲胺3的高效合成。

圖23 膽堿氧化酶和亞胺還原酶級(jí)聯(lián)催化合成仲胺的連續(xù)流系統(tǒng)[46]Fig.23 Continuous flow systems to access secondary amines by chemoenzymatic cascade[46]

近期，瞿旭東課題組的Zhu等[47]對(duì)亞胺還原酶進(jìn)行了分子改造，實(shí)現(xiàn)了一系列鄰位、間位、對(duì)位及多取代(S)-1-苯基-THβCs的高效合成(圖24)：通過級(jí)聯(lián)一個(gè)N-甲基轉(zhuǎn)移酶CNMT，將14種不同取代基的1-苯基- THβCs完全轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的N-甲基化產(chǎn)物；用S-腺苷-L-腺苷同型半胱氨酸(SAH)替代S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基基團(tuán)的供體參與轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)，通過腺苷蛋氨酸循環(huán)再生SAM，實(shí)現(xiàn)一鍋法合成(S)-N-甲基苯基-THβCs。

圖24 三酶級(jí)聯(lián)一鍋法生成N-甲基化1-苯基-THβCs[47]Fig.24 Synthesis of 1-aryl-tetrahydro-β-carbolines by imine reductase and methyltransferases[47]

4 亞胺還原酶的結(jié)構(gòu)及反應(yīng)機(jī)制

蛋白的三維結(jié)構(gòu)是理解酶催化機(jī)制的基礎(chǔ)，同時(shí)也是對(duì)酶進(jìn)行理性改造的起點(diǎn)。Grogan 課題組的Rodríguez-Mata等[48]于2013年解析了第一個(gè)亞胺還原酶的蛋白結(jié)構(gòu) (PDB：3ZHB)以來，截至目前，已有數(shù)十個(gè)亞胺還原酶的結(jié)構(gòu)被陸續(xù)解析。亞胺還原酶的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)同源二聚體模式，與β-羥基酸脫氫酶三維結(jié)構(gòu)相似，其中，蛋白的N端為Rossmann折疊，C端為α螺旋束，N端和C端之間由一條長(zhǎng)的α螺旋連接(圖25(a))，兩條單體之間相互交叉形成一個(gè)結(jié)構(gòu)空腔(圖25(b))。與其他NAD(P)H依賴的氧化還原酶一致，由位于N端的Rossmann折疊為輔酶NADPH提供結(jié)合口袋；與β-羥基酸脫氫酶所不同的是，亞胺還原酶的底物結(jié)合口袋位于由A鏈N端的Rossmann折疊與B鏈C端的α螺旋束通過交叉形成的空腔中[48]。

圖25 亞胺還原酶晶體結(jié)構(gòu)示意[48]Fig.25 The cartoon style of protein structure of imine reductase[48]

在反應(yīng)過程中，Asp187對(duì)亞胺離子中間體起穩(wěn)定以及質(zhì)子化的作用，隨后該亞胺離子中間體被來自輔酶煙酰胺環(huán)上C4位的氫原子還原為胺產(chǎn)物圖26 推測(cè)亞胺還原酶催化機(jī)制示意[48]Fig.26 Speculative reaction mechanism of imine reduction(CR) [48]

探究酶催化機(jī)制是生物催化研究不可或缺的部分，清晰的催化機(jī)制不僅可以揭示酶功能背后神秘的構(gòu)效關(guān)系，同時(shí)也可以為酶工程提供重要的參考信息。Rodríguez-Mata等[48]通過與催化機(jī)制已被闡述清楚的酮還原酶 (PDB：2CVZ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)，進(jìn)而推測(cè)亞胺還原酶(PDB：3ZHB)中的Asp187在亞胺還原反應(yīng)中扮演著催化殘基的角色(圖 26)?；诖?，他們將Asp187突變成Ala187或Asn187后發(fā)現(xiàn)，2個(gè)突變體均不再表現(xiàn)出亞胺還原活性。該研究似乎驗(yàn)證了Asp作為催化殘基的推測(cè)，但是隨后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，將其他亞胺還原酶對(duì)應(yīng)的該位點(diǎn)殘基突變成Ala、Gly及Asn等殘基時(shí)，酶依然具有還原亞胺的能力。不僅如此，在該殘基位點(diǎn)上是Ala或者Asn的新酶也具有亞胺還原活性[12]。進(jìn)一步通過分析酶與NADPH復(fù)合物發(fā)現(xiàn)，假定的催化殘基Asp187與NADPH的C4原子之間的距離超過了0.4 nm，超出了形成氫鍵的距離[48-50]。此外，分析酶-產(chǎn)物-NADPH的三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，假定的催化位點(diǎn)與氨基-NADPH形成的中間體的距離更遠(yuǎn)，如Asn171(對(duì)應(yīng)PDB：3ZHB中的Asp187)與芳香族產(chǎn)物之間的距離約為0.5 nm[12]。上述這些結(jié)構(gòu)上的現(xiàn)象均有悖于傳統(tǒng)的氧化還原酶催化機(jī)制。因此，將Asp187視作整個(gè)亞胺還原酶家族唯一的催化殘基這一機(jī)制是不完善的?；谶@一背景，隨后提出了其他的催化機(jī)制假說，如基于二氫葉酸脫氫酶所提出的氫鍵交互網(wǎng)絡(luò)催化假說[49,51]。雖然已有多個(gè)亞胺還原酶結(jié)構(gòu)已被解析，但是距離完全將其催化機(jī)制闡述清楚還任重而道遠(yuǎn)。綜上可知：①亞胺還原酶可能具有更為復(fù)雜的催化機(jī)制;②亞胺還原酶具有多樣性的催化機(jī)制。

5 人工亞胺還原酶

截至目前，盡管已有大量自然亞胺還原酶被挖掘表征，不過一些天然酶“與生俱來”的缺陷 (如，較差的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、有限的底物譜、昂貴的輔因子循環(huán)系統(tǒng)) 使得人工亞胺還原酶仍然具有潛在的研究前景[52]。由于金屬催化具有十分廣譜的催化范圍，因此在有機(jī)合成中被廣泛使用。基于此，近十幾年來已有不少研究者嘗試將多種金屬構(gòu)建到蛋白骨架中，使其以金屬酶的角色執(zhí)行催化亞胺還原的功能。相較于單純的金屬催化，構(gòu)建金屬亞胺還原酶具有4個(gè)優(yōu)點(diǎn)[51]：①金屬酶催化可在溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行；②蛋白骨架可保護(hù)金屬的催化能力不受外界環(huán)境的破壞；③金屬酶通常具有較高的催化效率；④金屬酶具有更高的立體選擇性。

多種蛋白質(zhì)骨架已被用于構(gòu)建金屬亞胺還原酶，最為常見的有鏈霉親和素、核糖核酸酶S、碳酸酐酶以及周質(zhì)結(jié)合蛋白[53-56]。Dürrenberger等[53]將芳烴釕通過雙齒配體將其整合到鏈霉親和素骨架中可以實(shí)現(xiàn)其在亞胺還原反應(yīng)中立體選擇性的從無到有。碳酸酐酶由于其在大腸桿菌中具有高表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，因此也常被當(dāng)作構(gòu)建人工金屬亞胺還原酶的重要蛋白載體。如Raines等[56]將具有催化不對(duì)稱加氫反應(yīng)IrCp*有機(jī)金屬催化劑整合進(jìn)碳酸酐酶骨架中，成功構(gòu)建出一種金屬亞胺還原酶。由此可見，作為天然亞胺還原酶的有利補(bǔ)充，人工金屬酶在亞胺還原研究領(lǐng)域也具有一定的研究潛力。

6 總結(jié)與展望

近年來，亞胺還原酶的研究取得了巨大的進(jìn)展，大量的天然亞胺還原酶已經(jīng)被鑒定，其催化功能不斷得到拓展，不僅可以用于催化亞胺的還原，還可以催化酮的還原胺化。但是相對(duì)轉(zhuǎn)氨酶、胺氧化酶等合成手性胺的酶系，對(duì)于該類酶的研究仍處于初始階段，目前高活性的天然亞胺還原酶還鮮有報(bào)道，亞胺還原酶的催化機(jī)制和天然功能還不清晰。未來在新酶的開發(fā)、酶催化混雜性、酶的分子改造、酶的催化機(jī)制解析、電酶催化等方面還值得深入研究和探索。

此外，該類酶的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用存在著極大的挑戰(zhàn)，需要解決活性低、立體選擇性不足、底物抑制等問題，需要借助定向進(jìn)化技術(shù)和工程強(qiáng)化手段來解決這些限制。在實(shí)際應(yīng)用中除了活性、穩(wěn)定性和選擇性等酶學(xué)性質(zhì)表征外，對(duì)生產(chǎn)性能表征也至關(guān)重要。底物加載量、催化劑加載量、產(chǎn)物得率和產(chǎn)物光學(xué)純度等生產(chǎn)性能可以更好反映酶催化劑的應(yīng)用潛力。