范利榮，晁 贏，閻祥慧，王建新，諸葛玉平，婁燕宏，王 會(huì)，潘 紅，楊全剛

（1.土肥資源高效利用國家工程研究中心 / 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 山東 泰安 271018；2.泰安高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科技創(chuàng)新部, 山東 泰安 271000；3.岱岳農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 山東 泰安 271000）

土壤重金屬污染受關(guān)注程度日益提高，據(jù)報(bào)道，我國農(nóng)田土壤重金屬污染面積約為2.5 × 108m2，每年生產(chǎn)的受污染糧食多達(dá)1.2 × 107t，造成的經(jīng)濟(jì)損失至少200 億元[1-2]。尤其值得特別關(guān)注的是，土壤鎘污染問題較為突出，據(jù)2014 年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，其點(diǎn)位超標(biāo)率為7.0%[3-4]。鎘污染具有隱蔽性、長期性及強(qiáng)致毒性等特點(diǎn)，同時(shí)其在土壤中的遷移能力較強(qiáng)，可通過食物鏈的富集對食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[5-6]。因此，如何有效開展受鎘污染農(nóng)田的安全利用成為當(dāng)前亟需解決的問題。

在鎘污染土壤上種植鎘低積累型品種，一方面可生產(chǎn)出符合國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)產(chǎn)品，另一方面可應(yīng)用于土壤鎘污染的修復(fù)。目前，已經(jīng)篩選獲得耐鎘小麥(Triticum aestivum)[7]、水稻(Oryza sativa)[8]、菜豆(Phaseolus vulgaris)[9]等。但是，對于谷子(Setaria italica)等特色糧草兼用作物耐鎘品種的篩選尚未見報(bào)道，種子萌發(fā)期作為作物生長發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，其生長狀況直接影響以后各生長發(fā)育階段及產(chǎn)量和品質(zhì)，在萌芽期進(jìn)行耐性的鑒定，具有操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)、環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)[10-12]。嚴(yán)加坤等[13]對3 份谷子品種進(jìn)行鎘脅迫處理，通過測定萌發(fā)期的指標(biāo)，篩選出綜合抗逆性最強(qiáng)的‘豫谷31 號(hào)’。另有研究在80 μmol·L-1鎘脅迫下，通過對尾穗莧(Amaranthus caudatus)萌發(fā)期指標(biāo)進(jìn)行分析，從16 份尾穗莧種質(zhì)中篩選出5 份耐鎘能力強(qiáng)的種質(zhì)[12]。本研究選用主栽區(qū)且應(yīng)用廣泛的58 份谷子品種，采用雙層濾紙法在100 mg·L-1鎘溶液進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，通過測定谷子品種的芽長、根長，利用主成分分析、聚類分析、隸屬函數(shù)法對其相對指標(biāo)進(jìn)行谷子品種萌發(fā)期耐鎘性綜合評價(jià)[14-15]，以期篩選出低鎘積累型谷子品種為耐鎘育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用品種均為我國谷子主要種植區(qū)的主栽品種，來源于遼寧、山西、河北、山東、吉林、北京等地區(qū)，具體名稱及來源如表1 所列。

表1 供試材料名稱及來源Table 1 Varieties and sources of the test material

1.2 試驗(yàn)處理

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)(設(shè)置0、50、100、150 mg·L-1共4個(gè)鎘濃度梯度)確定進(jìn)行耐鎘篩選的鎘處理濃度為100 mg·L-1。試驗(yàn)選取飽滿的谷子種子，用蒸餾水清洗，再用3.5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，然后用75%乙醇漂洗30 s[16]，最后用無菌蒸餾水多次漂洗。挑選出大小均勻的種子置于鋪有雙層濾紙的一次性培養(yǎng)皿(直徑11 cm)中，每皿20 粒。向培養(yǎng)皿中加入4 mL 的100 mg·L-1氯化鎘溶液以濕潤濾紙，并以蒸餾水作為對照，為保持濾紙濕潤采用稱重法及時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)濃度的鎘溶液。所有培養(yǎng)皿置于人工智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(發(fā)芽前避光處理，晝夜溫度25 ℃/19～21 ℃，箱內(nèi)濕度設(shè)置在75%～80%，2 d 后設(shè)置光周期為16 h/8 h)。當(dāng)胚芽達(dá)到種子長度一半或胚根達(dá)到種子長度記為發(fā)芽，每2 d 記錄種子發(fā)芽情況，培養(yǎng)8 d 后用10 cm 直尺測量胚根與胚芽長度，每個(gè)處理3 次重復(fù)，共174 皿，隨機(jī)排列。谷子種質(zhì)發(fā)芽勢、發(fā)芽率根據(jù)GB/T 5520－2011 《糧食、油料檢驗(yàn)種子發(fā)芽試驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)》公式計(jì)算。

相對發(fā)芽率 = 處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率 × 100%；

相對發(fā)芽勢 = 處理發(fā)芽勢/對照發(fā)芽勢 × 100%；

相對芽長 = 處理芽長/對照芽長 × 100%；

相對根長 = 處理根長/對照根長 × 100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用SPSS 22.0 進(jìn)行相關(guān)性分析、聚類分析、主成分分析，運(yùn)用Origin 進(jìn)行頻率分析。將谷子品種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢以平方歐式距離作為供試谷子種質(zhì)間距離，以最短距離法為聚類方法，進(jìn)行聚類分析，建立種質(zhì)資源聚類樹狀圖。隸屬函數(shù)值X(ij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)[17]。X(ij)表 示i品 種j指 標(biāo)隸屬值，Xij表示i品種j指標(biāo)測定值，Xjmax為j指標(biāo)測定最大值，Xjmin為j指標(biāo)最小值。

式中：Pj代表各材料第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對谷子種子萌發(fā)的影響

鎘脅迫下，谷子種子萌發(fā)特性受基因型影響較大(表1)。其中，GZ05 在鎘脅迫下未發(fā)芽，說明此品種對鎘脅迫十分敏感，受鎘影響嚴(yán)重。頻率分析表明(圖1)，58 份谷子的芽長、根長、發(fā)芽率、發(fā)芽勢均值分別為0.81 cm、1.19 cm、30.00%、19.00%，變異系數(shù)分別為32.68%、60.55%、65.67%、65.35%，根長變異系數(shù) > 芽長變異系數(shù)，說明根長比芽長更易受到鎘脅迫的影響，這可能與根是植物首先接觸重金屬鎘的器官有關(guān)。

圖1 谷子種質(zhì)芽長、根長、發(fā)芽率、發(fā)芽勢頻率分析Figure 1 Analysis of bud length, root length, germination rate, and germination potential frequencies of millet accessions

58 份谷子品種的相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢均值分別為40.07%和35.22%，兩指標(biāo)的變異系數(shù)分別為57.56%和57.80% (表2)，說明鎘脅迫對谷子萌發(fā)生長的影響在基因型間差異較大。58 份谷子品種的相對芽長、相對根長均值分別為64.31%和19.96%，變異系數(shù)分別為29.53%和50.83%，相對根長的變異系數(shù)大于相對芽長，說明在同濃度鎘脅迫下，根長比芽長更易受到鎘脅迫的影響，這與鎘脅迫下鹽芥(Thellungiella hallophila)的研究結(jié)果[18]相似。

2.2 主成分分析

通過對鎘脅迫下8 個(gè)萌發(fā)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，選擇特征值 > 1 的成分，提取出3 個(gè)主成分(表3)。3 個(gè)主成分因子累計(jì)貢獻(xiàn)率為89.81%，說明提取的3 個(gè)主成分能夠代表原來8 個(gè)指標(biāo)信息的絕大部分信息。

表3 3 個(gè)主成分的特征值、貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of three principal components

根據(jù)3 個(gè)主成分系數(shù)，得到Y(jié)1、Y2、Y3的線性組合：

式中：X1為發(fā)芽率，X2為發(fā)芽勢，X3為相對發(fā)芽率，X4為相對發(fā)芽勢，X5為相對根長，X6為根長，X7為相對芽長，X8為芽長。在主成分Y1中，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢的系數(shù)絕對值大于其他變量的系數(shù)絕對值，所以主成分Y1是4 個(gè)萌發(fā)指標(biāo)的綜合反映，代表谷子種質(zhì)在鎘脅迫下的萌發(fā)情況，說明這4 個(gè)萌發(fā)指標(biāo)對篩選谷子耐鎘性是必不可少的。在主成分Y2、Y3中，相對根長、根長、相對芽長、芽長的系數(shù)絕對值大于其他變量的系數(shù)絕對值，代表谷子種質(zhì)在鎘脅迫下的生長情況。

表4 是根據(jù)主成分方程(即上述的3 個(gè)線性組合方程)計(jì)算的主成分得分和綜合得分(Y= 0.4852Y1+ 0.2811Y2+ 0.1318Y3)，綜 合 得 分 > 1 的 種 質(zhì) 有11 份： GZ12、 GZ11、 GZ55、 GZ17、 GZ02、 GZ43、GZ03、GZ53、GZ50、GZ41、GZ18，說明在鎘脅迫下這11 份種質(zhì)萌發(fā)生長情況較好；有31 份種質(zhì)綜合得分 < 0，說明受鎘脅迫影響較大。

2.3 谷子品種耐鎘性綜合評價(jià)

2.3.1 聚 類分析

運(yùn)用系統(tǒng)聚類對谷子品種的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢進(jìn)行聚類分析(圖2)，58 份谷子種質(zhì)可分為3 個(gè)類群：A 類包括GZ02、GZ03、GZ09、GZ11 等12 個(gè)品種(占比20.7%)，屬于耐鎘型，其發(fā)芽率 > 50%，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢均 > 60%；B 類包括GZ23、GZ06、GZ44、GZ15 等13 份種質(zhì)(占比22.4%)，屬于中間型，其發(fā)芽率為25%～55%，相對發(fā)芽率為40%～65%，相對發(fā)芽勢為30%～45%；C 類包括GZ16、GZ33、GZ25、GZ30等33 份種質(zhì)(占比56.9%)，屬于鎘敏感型，其發(fā)芽率 < 20%，相對發(fā)芽率 < 40%，相對發(fā)芽勢 < 38%。

圖2 谷子種質(zhì)聚類分析樹狀圖Figure 2 Millet germplasm cluster analysis dendrogram

2.3.2 耐 鎘性綜合評價(jià)

利用隸屬函數(shù)對谷子萌發(fā)指標(biāo)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢)計(jì)算綜合得分，對58 份谷子種質(zhì)耐鎘性進(jìn)行綜合評價(jià)(表5)。選取排名前8 的為耐鎘品種(綜合得分 > 5.00)，分別是GZ02、 GZ43、 GZ12、 GZ11、 GZ17、 GZ55、 GZ03、GZ50，結(jié)合聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 個(gè)品種屬于聚類分析中的耐鎘型品種，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢均≥ 60%，占比13.8%。

表5 58 份谷子種質(zhì)的耐鎘性綜合評價(jià)值Table 5 Comprehensive evaluation of the cadmium tolerance of 58 millet germplasms

3 討論與結(jié)論

作物豐富的種質(zhì)資源表現(xiàn)出相應(yīng)的遺傳多樣性。從作物種質(zhì)中篩選耐鎘品種是開展植物修復(fù)的基礎(chǔ)，而種子萌發(fā)在作物生育期屬于起始點(diǎn)，在脅迫條件下，種子萌發(fā)及出苗情況可作為鑒定抗性的重要指標(biāo)[19]。采用雙層濾紙法在100 mg·L-1鎘脅迫下，58 份谷子品種的相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢均值為40.07%和35.22%，兩指標(biāo)的變異系數(shù)分別為57.56%和57.80%，說明鎘脅迫對谷子萌發(fā)生長的影響在基因型間差異較大，其中GZ05 在鎘脅迫下未發(fā)芽，說明其對鎘脅迫極為敏感。有研究表明在20～200 mg·L-1鎘濃度下，苜蓿(牧歌)種子發(fā)芽勢顯著降低，100 mg·L-1鎘濃度下，其發(fā)芽率顯著降低[11]。同時(shí)，研究其萌發(fā)后的生長特性也至關(guān)重要，種子萌發(fā)后其幼苗生長情況一定程度上可反映出對鎘脅迫的抗性[20-22]。張盼盼等[23]在200 μmol·L-1鎘溶液脅迫下對不同糜子(Panicum miliaceum)品種種子胚芽長、胚根長發(fā)芽率等指標(biāo)測定，篩選出9 份可作為耐鎘糜子品種應(yīng)用于礦區(qū)鎘污染土壤修復(fù)。從幼苗生長狀況來看，相對根長的變異系數(shù)大于相對芽長的變異系數(shù)，說明在同濃度鎘脅迫下，根長比芽長更易受到鎘脅迫的影響，這與前人研究的鎘脅迫對玉米(Zea mays)種子幼苗生長的結(jié)果相似[24]。也有研究[25]發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫處理濃度大于150 mmol.L-1時(shí)，對谷子幼苗胚根的抑制作用大于胚芽。另有研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫對水稻萌發(fā)期、辣椒(Capsicum annuum)根長生長抑制效果較為明顯[26-27]。這應(yīng)與種子萌發(fā)過程有關(guān)，種子吸水膨脹后，胚根先突破種皮接觸鎘溶液，使胚根在鎘積累量、脅迫時(shí)間上大于胚芽，從而使谷子根長受鎘毒害大于芽長。另外，根系在遭受鎘脅迫下會(huì)產(chǎn)生逆境乙烯對細(xì)胞造成傷害，此傷害也首先發(fā)生在根部[24]。

為了更好地、簡便地、全面地開展谷子耐鎘性的評價(jià)，本研究利用主成分分析、聚類分析、隸屬函數(shù)法相結(jié)合的方法對谷子種質(zhì)的耐鎘性進(jìn)行綜合評價(jià)。有研究利用主成分分析、聚類分析、隸屬函數(shù)法對花生萌發(fā)期的各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)及耐鹽種質(zhì)的篩選，篩選出6 份耐鹽性強(qiáng)的種質(zhì)[28]。通過主成分分析將耐鎘性指標(biāo)提取出3 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)89.81%，可代表原始指標(biāo)攜帶的絕大部分信息，為谷子種質(zhì)資源篩選提供有利依據(jù)。采用聚類分析和隸屬函數(shù)分析相結(jié)合的方法，一方面確定了58 份谷子的耐鎘特性分為耐鎘型品種(占比20.7%)、中間型品種(占比22.4%)和鎘敏感型品種(占比56.9%)，另一方面篩選獲得了8 份耐鎘種質(zhì)(相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢≥ 60%)。

本研究通過對58 份主要種植區(qū)的谷子種質(zhì)資源進(jìn)行耐鎘性性鑒定試驗(yàn)，初步篩選獲得多份耐鎘種質(zhì)，可應(yīng)用于鎘污染土壤的修復(fù)治理，但對其籽粒積累鎘的特性還有待進(jìn)一步研究。