王燕茹，袁秉琛，孫郁婷，李承臻，王志勇，虞道耿

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所, 海南 海口 571101；2.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院,海南 海口 570228；3.海南大學(xué)林學(xué)院, 海南 海口 570228）

蝴蝶豆(Centrosema pubescens)是豆科距瓣豆屬多年生草質(zhì)藤本植物，其起源于南美洲，現(xiàn)分布于東南亞，并適合生長在熱帶、亞熱帶潮濕或中度濕潤地區(qū)[1-2]，在我國被引種栽培在廣東、海南、臺(tái)灣、江蘇、云南等地。蝴蝶豆主要生長在pH 為4.9～5.5 的肥沃沙壤土，在干旱、酸性、排水不良和低肥力土壤中也可生長[3-5]。蝴蝶豆具有多種特點(diǎn)，包括耐旱、耐陰[6]、適口性好、能固氮等，且具有抵御葉斑病和紅蜘蛛侵害的能力，還能抵制雜草的入侵。因此被認(rèn)為是一種優(yōu)良的綠肥和覆蓋植物，其莖葉還可以用作飼料[7-12]，在熱帶山區(qū)草牧業(yè)發(fā)展中具重要作用。

蝴蝶豆的莖葉非常嫩，即使在生長了18 個(gè)月后仍然沒有木質(zhì)化。其葉數(shù)量多，產(chǎn)量高，每年可以產(chǎn)出30～45 t·hm-2；蝴蝶豆的莖葉富含豐富的營養(yǎng)，尤其是高蛋白質(zhì)，是家畜非常喜歡食用的綠飼料。因此被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)的高蛋白質(zhì)飼料，適用于各種家畜和家禽，包括牛、羊、豬、禽類和兔等。蝴蝶豆與大黍(Panicum maximum)、象草(Pennisetum purpureum)、糖蜜草(Melinis minutiflora)、毛花雀稗(Paspalum dilatatum)和 毛 蔓 豆 (Calopogonium mucunoides)等混播產(chǎn)量、營養(yǎng)價(jià)值有所提高。在美國佛羅里達(dá)州，如果只種植俯仰馬唐(Digitaria eriantha)產(chǎn)量只有5.24 t·hm-2，但是，如果將蝴蝶豆與俯仰馬唐混播種植，產(chǎn)草量可增加到9.39 t·hm-2，且俯仰馬唐的粗蛋白含量能從6.3%提高到9.9%。此外，在巴西的放牧試驗(yàn)結(jié)果顯示，在蝴蝶豆和俯仰馬唐的混播草地中放牧肉牛的鮮重比單一俯仰馬唐草地高17.4%[13]。

植物遺傳多樣性主要通過穩(wěn)定且易于區(qū)分的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性來反映。遺傳標(biāo)記的類型包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記以及分子標(biāo)記[14]等多種方法，每一種標(biāo)記方法都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)[15]。形態(tài)學(xué)標(biāo)記通過人眼直接觀察植物品質(zhì)性狀得出，與其他標(biāo)記方法相比，經(jīng)濟(jì)、直觀，在植物莖、葉、花果等的分類鑒定中，已被廣泛使用在南瓜(Cucurbita moschata)[16]、番茄(Solanum lycopersicum)[17]、桑樹(Morus alba)[18]、文冠果(Xanthoceras sorbifolium)[19]等物種上。例如，對(duì)142 份番茄種質(zhì)植株、產(chǎn)量、果實(shí)和品質(zhì)等方面的47 個(gè)性狀進(jìn)行遺傳多樣性和相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)該種質(zhì)為自然群體，且遺傳變異較豐富。

早在1969 年美國俄克拉荷馬州立大學(xué)學(xué)者根據(jù)狗牙根(Cynodon dactylon)的莖、生長習(xí)性，葉、株型等性狀，將其分為6 個(gè)變種，建立了分類學(xué)上的骨架[20]。張小艾和張新全[21]研究了西南地區(qū)的野生狗牙根的遺傳多樣性，通過考察20 個(gè)綜合性狀，如種群自然高度、葉長和葉寬等，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的野生狗牙根具有豐富的遺傳多樣性，并將其分為4 個(gè)主要類別。嚴(yán)琳玲等[22]對(duì)76 份山螞蝗屬(Desmodium)種質(zhì)的32 個(gè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了分析，并將其分為7 類。謝向譽(yù)等[23]對(duì)31 份木薯(Manihot esculenta)種質(zhì)資源植物學(xué)性狀初步鑒定評(píng)價(jià)，篩選出13 份株型較好的資源。蝴蝶豆表現(xiàn)優(yōu)良，可在磚壤土里生長，管理粗放、可作飼料、牧草，但目前尚未應(yīng)用形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行遺傳多樣性研究。

鑒于此，本研究以75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)資源為研究材料，將質(zhì)量性狀與數(shù)量性狀相結(jié)合，對(duì)38 個(gè)植物學(xué)性狀進(jìn)行觀測(cè)，分析其形態(tài)學(xué)遺傳多樣性，對(duì)蝴蝶豆屬種質(zhì)資源植物學(xué)性狀及農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)及分類[17]，為選育蝴蝶豆新品種提供候選材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在試驗(yàn)中使用的75 份蝴蝶豆種質(zhì)，這些種質(zhì)包括 International Center for Tropical Agriculture(CIAT)引進(jìn)的國外資源和國內(nèi)野外收集的資源，涵蓋了1 個(gè)屬(蝴蝶豆屬)下的3 個(gè)種，分別是蝴蝶豆、大果蝴蝶豆(1 個(gè))、尖葉蝴蝶豆(1 個(gè)) (表1)，經(jīng)緯度及來源如附表1 所列。

表1 供試材料Table 1 Accessions used in this study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田 間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

75 份蝴蝶豆屬種質(zhì)資源種植在海南省儋州市科技園區(qū)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品資所牧草中心試驗(yàn)基地(19°31′22.63″ N， 109°34′36.00″ E)，試驗(yàn)地為熱帶季風(fēng)氣候，光熱條件好，雨水充沛，雨熱同期[24]。磚壤土，pH 4.5，肥力較低。

1.2.2 植物學(xué)性狀調(diào)查及指標(biāo)

在田間試驗(yàn)中，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)材料小區(qū)的種植規(guī)格為1 m × 3 m，每個(gè)小區(qū)種植15 株蝴蝶豆，株距為0.5 m，行距為0.5 m。在蝴蝶豆成熟期(12 月中旬)調(diào)查植物學(xué)性狀，每小區(qū)隨機(jī)抽取5 株。根據(jù)《熱帶牧草種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范》[25](表2)測(cè)量蝴蝶豆屬種質(zhì)資源生活型，莖、葉、花、莢果和自然高度等共38 個(gè)植物學(xué)性狀；其中，中央小葉長和小葉寬，葉長度和寬度，莢果長度、寬度和自然高度為數(shù)量指標(biāo)，其余均為質(zhì)量指標(biāo)。

表2 蝴蝶豆屬種質(zhì)植物學(xué)性狀賦值Table 2 Assignment of botanic characters

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 相 關(guān) 遺 傳 參 數(shù) 計(jì) 算

通過調(diào)查和統(tǒng)計(jì)蝴蝶豆的各項(xiàng)指標(biāo)，使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，得出各種質(zhì)量性狀的分布頻率。同時(shí)，利用公式計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)(H)。針對(duì)每個(gè)植物學(xué)性狀，計(jì)算出其最小值、最大值、極差、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)等統(tǒng)計(jì)量。使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)38 個(gè)植物學(xué)性狀指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析[26]。

1.3.2 聚 類分析

對(duì)75 份蝴蝶豆屬資源的38 個(gè)植物學(xué)性狀指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用SPSS 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。采用歐式距離作為各指標(biāo)之間的距離度量，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以研究各物種之間的相關(guān)性。歐式距離越大，表示兩者之間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，遺傳差異越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶豆種質(zhì)資源植物學(xué)性狀頻率分布

蝴蝶豆資源31 個(gè)質(zhì)量性狀中，葉色、旗瓣顏色、莢果顏色的遺傳多樣性指數(shù)均大于1；其中，莢果顏色多樣性指數(shù)最高(1.46)，生活型、莖生長習(xí)性、葉的類型、中央小葉脈序、葉緣、葉柄毛況、托葉質(zhì)地、花序類型、雄蕊類型、雌蕊類型、莢果毛況、裂莢性12 個(gè)質(zhì)量性狀多樣性指數(shù)均為0 (表3)。在蝴蝶豆莢果顏色形狀中，紅褐色分布頻率最高，達(dá)44.0%，深綠色分布頻率最低，為1.3%；葉色性狀中，綠色葉分布頻率最高，為49.3%，淺綠色葉分布頻率最低，為17.3%；旗瓣顏色中，白色分布頻率最大，為38.7%，淺藍(lán)分布頻率最小，為1.3%?？梢姡构v以紅褐為主，葉色以綠色為主，旗瓣顏色以白色為主。

表3 蝴蝶豆種質(zhì)資源質(zhì)量性狀頻率分布Table 3 Frequency distribution of quality traits

2.2 蝴蝶豆種質(zhì)植物學(xué)性狀的變異性

75 份蝴蝶豆屬資源的38 個(gè)植物學(xué)性狀結(jié)果顯示，旗瓣顏色的植物學(xué)性狀變異系數(shù)最大達(dá)到79.68%，其次是莖毛況和葉背面毛況，它們的變異系數(shù)分別為46.03%和42.18% (表4)。另外，關(guān)于生活型、莖生長習(xí)性、葉類型、中央小葉脈序、葉緣、葉柄毛況、花序類型、雄蕊類型、雌蕊類型、莢果毛況、裂莢性這11 個(gè)質(zhì)量性狀，沒有觀察到任何變異情況，這說明蝴蝶豆植物學(xué)性狀穩(wěn)定，而且具有豐富的遺傳多樣性。所測(cè)定指標(biāo)中，葉片相關(guān)指標(biāo)有19 個(gè)，變異系數(shù)平均值為18.5%；莖相關(guān)指標(biāo)有5 個(gè)，變異系數(shù)平均值為26%；花果相關(guān)指標(biāo)12 個(gè)，變異系數(shù)平均值為16%。多重比較發(fā)現(xiàn)，蝴蝶豆的葉、莖、花、莢果、生活型的變異系數(shù)平均值沒有顯著差異(表5)，這說明蝴蝶豆的遺傳多樣性來源分布比較均勻。所測(cè)38 個(gè)指標(biāo)中，旗瓣顏色、莖毛況、葉背面毛況、葉片腹毛況變異系數(shù)最大。說明，蝴蝶豆遺傳多樣性來源分布均勻，其旗瓣顏色、莖毛況、葉背面毛況和葉片腹毛況在其遺傳多樣性中起關(guān)鍵作用。

表4 蝴蝶豆屬供試材料各性狀的變異情況Table 4 Variation in morphological traits of the accessions

表5 蝴蝶豆屬莖、葉、花、莢果的多重比較Table 5 LSD multiple comparison of stems, leaves, flowers, and pods of Phaseolus

2.3 蝴蝶豆種質(zhì)植物學(xué)性狀間的相關(guān)性

27 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差不為0 的蝴蝶豆植物學(xué)性狀指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，個(gè)別組性狀間存在顯著(P<0.05)、極顯著相關(guān)關(guān)系(P< 0.01)，其中有8 個(gè)性狀與自然高度呈顯著、極顯著關(guān)系；說明，蝴蝶豆各性狀并非獨(dú)立存在，且與自然高度相關(guān)緊密(表6)。莖毛況與莖毛類型、葉背面毛況、葉寬度3 個(gè)性狀呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.782、0.381、0.298；與小葉長、小葉寬、葉長度3 個(gè)性狀呈顯著相關(guān)；說明莖毛況和葉長、寬以及植株生長自然高度存在關(guān)聯(lián)，葉片越長越寬且自然高度越高莖毛越密。葉色、小葉長、小葉寬、葉長、葉寬這5 個(gè)性狀都與自然高度呈顯著關(guān)系，說明自然高度是決定葉色、小葉長、小葉寬、葉長、葉寬的主要因素。托葉與托葉形狀、托葉質(zhì)地呈極顯著相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.432、0.941，說明同一物質(zhì)結(jié)構(gòu)的各項(xiàng)性狀間相關(guān)性較高。

表6 蝴蝶豆屬植物學(xué)性狀間的相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients among botanical characters

2.4 蝴蝶豆種質(zhì)資源植物學(xué)性狀的主成分分析

對(duì)27 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差不為0 的形狀指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析(表7)。使用主成分分析，根據(jù)各主成分的特征值和貢獻(xiàn)率，提取成分。在此過程中，特征值大于1 的主成分共有10 個(gè)，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率74.493%。這些主成分可以代表所有指標(biāo)的大部分信息，因此可以作為蝴蝶豆種質(zhì)初步評(píng)價(jià)篩選的綜合指標(biāo)。并通過載荷矩陣(表8)可知影響第1 主成分(貢獻(xiàn)率18.145%)的主要性狀為葉寬度和小葉長，表明它主要反映葉片大小；影響第2 主成分(貢獻(xiàn)率11.391%)為托葉形狀和葉片毛被類型，說明第2 主成分主要反映葉片被毛情況；第3 主成分反映了托葉特性；第4 主成分和第5 主成分反映了莢果特性；第6 主成分和第7 主成分主要影響因子為莖顏色和莖的形狀，反映了莖的情況；第8 主成分的貢獻(xiàn)率為1.181%，影響性狀為旗瓣形狀，反映旗瓣情況；莖形狀為第9 主成分的影響因子，葉色為第10 主成分的影響因子。由此得出影響變異的主要性狀指標(biāo)為葉寬度、托葉形狀、托葉、莢果長度、莖顏色、旗瓣形狀、莢果寬度、莖形狀、葉色。

表7 各指標(biāo)主成分的方差貢獻(xiàn)率Table 7 Variance contribution rate of principal components of each index

表8 各指標(biāo)主成分載荷矩陣Table 8 Principal component load matrix of each index

2.5 蝴蝶豆種質(zhì)資源植物學(xué)性狀的系統(tǒng)聚類分析與綜合排名

對(duì)于75 份蝴蝶豆種質(zhì)資源材料的27 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差不為0 的性狀指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行了系統(tǒng)聚類分析，并得到聚類圖(圖1)。聚類分析結(jié)果并表明，所有材料的遺傳距離范圍為2.611～13.626，說明這些蝴蝶豆屬種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。其中，3 號(hào)和68 號(hào)的歐式距離最小，二者歸為一類；23 號(hào)和26 號(hào)歐式距離最大，二者分為兩類。

圖1 蝴蝶豆屬植物學(xué)性狀聚類分析圖Figure 1 Cluster analysis of botanical characters of genus Phaseolus

當(dāng)歐式距離為10 時(shí)，可將75 份蝴蝶豆種質(zhì)資源分為11 大類。其中，第1 大類包括3、68、42、73、48、51、43、63、29、47、17、10、30、15、37、75、21、58、57、19、35、56、46、6、55、8、12、40、31、4、61、1、50、28、39、20、71、59、62、66、24、38、69、34、13，共45 份材料，主要以海南本地收集的野生材料為主，少數(shù)為國外引進(jìn)材料，這些材料莖毛多、葉片具密毛、葉片小、自然高度低等特點(diǎn)；第2 大類有44、54、74、22、60，共5 材料表現(xiàn)；第3 大類有5、64；第4 大類有49、70；第5 大類有2、18、11、53、25、7；第6 大類有27、52、9、33；第7 大類有14、32、72、41、65、45；剩余材料16、67、26 分別單獨(dú)聚為1 類；第11 大類有23、36。第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 大類這些材料莖毛無或少、葉片無毛、葉片大、自然高度高等特點(diǎn)。說明，國外引進(jìn)材料與海南野生收集的多數(shù)材料親緣關(guān)系較近，且國內(nèi)收集的野生資源跨類較多、種間變異較大。通過綜合D 值對(duì)所有材料進(jìn)行排名(表9)，最終篩選出3 份材料，編號(hào)45、14、32 材料整體表現(xiàn)最優(yōu)。

表9 綜合排名Table 9 Comprehensive ranking

3 討論

目前，對(duì)于蝴蝶豆的研究主要集中在施肥、產(chǎn)量、耐陰性、抗旱性及發(fā)芽方法等方面[27-29]。在國外，研究人員主要關(guān)注于蝴蝶豆的兩個(gè)方面，即其作為飼草料的利用以及其在固氮方面的作用[30]。在有關(guān)蝴蝶豆屬種質(zhì)資源的形態(tài)學(xué)標(biāo)記方面相關(guān)內(nèi)容尚未研究，而我國南方熱區(qū)種植的優(yōu)異豆科牧草品種較少，可以通過培育優(yōu)異的豆科藤本牧草品種，滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)的迫切需要。

此次遺傳多樣性研究結(jié)果表明，葉色、旗瓣顏色、莢果顏色的遺傳多樣性指數(shù)均大于1，且旗瓣顏色變異系數(shù)最大，說明同屬植物不同種質(zhì)之間的遺傳多樣性由葉與旗瓣控制，旗瓣顏色在一定程度上是新品種選育中最直觀的觀測(cè)指標(biāo)，這與嚴(yán)琳玲等[22]和許文婷等[31]研究結(jié)果一致；與趙喜萍[32]認(rèn)為花的變異性比其他性狀更為豐富相一致。

研究表明，牧草品質(zhì)有很多因素影響。植物的生長特性，如高度、葉形和葉片大小，與牧草的產(chǎn)量密切相關(guān)。此外，生活型、莖生長習(xí)性、葉片大小等指標(biāo)也會(huì)對(duì)牧草的產(chǎn)量產(chǎn)生影響[33]；而葉尖的存在與否、莢果的特征、莖和葉片的毛發(fā)等特征也會(huì)對(duì)牧草的飼用品質(zhì)產(chǎn)生影響[34]。本研究通過相關(guān)性分析表明有8 個(gè)性狀與自然高度呈顯著、極顯著關(guān)系，說明蝴蝶豆各性狀并非獨(dú)立存在，而是有相關(guān)性的，且大多數(shù)都與自然高度相關(guān)，這與王鶴琪[35]對(duì)松嫩草地30 種植物形態(tài)性狀、產(chǎn)量及品質(zhì)相互關(guān)系研究結(jié)果一致，自然高度對(duì)單株產(chǎn)量(葉干重、莖干重)及品質(zhì)(粗蛋白)具有一定的指示作用；與馬崇堅(jiān)等[36]認(rèn)為皇竹草(Pennisetum sinese)植株株高、分蘗數(shù)、有效莖數(shù)和產(chǎn)量相互間關(guān)系極顯著正相關(guān)結(jié)果一致；與耿小麗等[37]認(rèn)為葉片寬度與株高有密切關(guān)系的結(jié)論一致。本研究主成分分析提取出10 個(gè)主成分。這10 個(gè)主成分反映了蝴蝶豆莖、葉、花、果的整體情況，而葉寬度、托葉形狀、托葉、莢果長度、莖顏色、旗瓣形狀、莢果寬度、莖形狀、葉色在主成分元件中數(shù)值最大說明這些形狀與主成分關(guān)系密切，是影響變異的主要形狀指標(biāo)，這與變異分析結(jié)果相符。因此，通過株高、葉形和莢果的大小、中央小葉指標(biāo)來挑選高產(chǎn)候選材料；通過葉尖有無或整株被毛狀況來挑選適口性好[38]的材料，從而獲得最佳育種候選材料。

通過將所測(cè)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，在歐式距離10 處將75 份蝴蝶豆分為11 大類，說明蝴蝶豆種內(nèi)變異較大。聚類分析結(jié)果第7 大類包括6 份，并通過綜合D 值，對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)差不為0 的蝴蝶豆植物學(xué)性狀指標(biāo)權(quán)重進(jìn)行排序[39]，D 值越小說明表型越好，篩選出050319012 距瓣豆、CIAT25118 草地蝴蝶豆、060301016 蝴蝶豆共3 份葉片柔毛少、小葉寬度大、可作為蝴蝶豆優(yōu)異的候選材料。

表型變異只能通過直接觀測(cè)表型的變化得到想要的優(yōu)異材料，而于分子標(biāo)記可以直觀、快速、經(jīng)濟(jì)地判斷種質(zhì)的好壞，分子標(biāo)記遺傳變異是在表型變異的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，目前的研究尚未結(jié)合分子標(biāo)記等方法對(duì)資源進(jìn)行鑒定。因此，下一步應(yīng)結(jié)合分子水平的基因鑒定方法對(duì)初步篩選出的優(yōu)良資源進(jìn)行進(jìn)一步鑒定評(píng)價(jià)，以便更好地開發(fā)利用蝴蝶豆資源。

4 結(jié)論

本研究詳細(xì)研究了蝴蝶豆屬植物資源之間的形態(tài)學(xué)遺傳多樣性特征，確定了旗瓣顏色、莖毛情況和葉背面毛況的變異系數(shù)是區(qū)分蝴蝶豆屬種質(zhì)資源的重要指標(biāo)。通過聚類分析并結(jié)合所測(cè)形態(tài)學(xué)指標(biāo)，篩選出050319012 距瓣豆、CIAT25118 草地蝴蝶豆、060301016 蝴蝶豆葉片柔毛少，小葉寬度大，高產(chǎn)量等特點(diǎn)的蝴蝶豆屬材料，為蝴蝶豆屬種質(zhì)資源后續(xù)植物學(xué)性狀分子標(biāo)記提供育種候選材料，為評(píng)價(jià)蝴蝶豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值提供參考。