楊波 劉曙艷 王林 姬松波 李玉生

(焦作市第二人民醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科,河南 焦作 454150;2內(nèi)分泌科;3鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

腦小血管病(CSVD)是小血管病變中一組特殊的實體綜合征,包括各種病理改變對腦組織結構的破壞,需要影像學輔助診斷。對于已經(jīng)受損的小血管來說,一旦堵塞或出血,就無法恢復〔1〕。在解剖學上CSVD是腦血管的一部分,在病理學中CSVD歸屬于腦血管病,CSVD的病理進展過程非常緩慢。腦微血管內(nèi)皮細胞中釋放的氧自由基可誘導細胞色素C釋放至細胞質(zhì),細胞質(zhì)中的細胞色素C可誘導細胞凋亡,從而加重腦組織損傷〔2,3〕。miR-150-5p與CSVD發(fā)生有一定關系,參與微血管內(nèi)皮細胞的CSVD患者外周血miR-150-5p表達明顯降低〔4〕。因此,本研究將干擾miR-150-5p表達量來分析CSVD大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞凋亡的情況。

1 材料與方法

1.1動物 雄性健康大鼠56只,3～4個月齡,體質(zhì)量(300±28)g,動物實驗許可證號為SCXK(京)2017-0003,購自北京斯貝有限公司,在標準環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠1 w,提供自由進水、飲食。5 d開始實驗,本試驗嚴格按照動物實驗道德倫理要求進行,并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審批和同意。

1.2主要試劑及儀器 miR-150-5p激動劑、 miR-150-5p抑制劑(上海寶曼生物科技有限公司)、miRNA 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(北京伊塔生物科技有限公司)、胰蛋白酶(北京孚博生物科技有限公司)、RIPA裂解液(北京邦興業(yè)科技有限公司)。

1.3分組及建模 56只大鼠隨機分為正常組、模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各14只。正常組不做任何處理,剩余組進行建模,采用同種系微栓子體外注入法。自體血栓制備:大鼠左心室采血,放在干燥箱內(nèi)完全干燥后,將干燥血凝塊研細,過200 μm篩孔制成栓。建模時用鹽水配成10∶1混合液。使用1.5%戊巴比妥鈉在大鼠腹腔內(nèi)注射進行麻醉后,由頸外動脈的近心端逆行注射0.3 ml混合液入頸內(nèi)動脈?？p合頸前切口,表面消毒。大鼠發(fā)作癲癇、四肢癱瘓和異常運動表示建模成功,建模過程中死亡6只,最終建模成功42只。

1.4miR-150-5p轉(zhuǎn)染 在建模完成后5 d做miR-150-5p轉(zhuǎn)染,正常組、模型組不做處理,上調(diào)組和下調(diào)組分別用 miRNA 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合miR-150-5p激動劑或 miR-150-5p抑制劑,靜止30 min左右,滴入腦組織細胞中。

1.5轉(zhuǎn)染效率鑒定 在轉(zhuǎn)染2 d后隨機選取各組5只大鼠,使用脫頸法處死大鼠后取腦組織,所提取的RNA濃度、完整性采用比色法、瓊脂糖凝膠電泳法測定,使用多基因梯度做實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)鑒定miR-150-5p轉(zhuǎn)染效率,以U6為內(nèi)參照,反應過程為95 ℃ 12 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 5 s延伸,40個循環(huán)。相對表達量用2-ΔΔCt計算。

1.6樣本采集 采用脫頸法處死大鼠,放入75%乙醇中浸泡5 min,沿腦部正中線剪開顱骨,去除硬腦膜,剔除小腦及腦干,腦組織于磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗,去除大血管等組織,剪切腦組織呈1 mm組織塊,采用PBS洗滌灰質(zhì)組織,加入0.05%胰蛋白酶消化25 min,加入有胎牛血清的培養(yǎng)基停止消化,采用200目尼龍篩過濾,4 ℃條件下1 000 r/min離心5 min,收集細胞沉淀,加入0.1%膠原酶,室溫育30 min,加入培養(yǎng)基懸浮細胞,將細胞于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d,采用0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng),取細胞進行實驗。

1.7病理學觀察 取組織切片常規(guī)處理后蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察各組內(nèi)皮血管組織病理變化。

1.8指標檢測 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平檢測:取各組腦微血管內(nèi)皮細胞,使用RIPA裂解液裂解細胞,用超聲破碎細胞,在4 ℃溫度下經(jīng)1 000 r/min離心5 min,取上清,采用化學比色法檢測各組MDA、SOD活性,嚴格遵守檢測試劑盒上的說明書進行操作。細胞凋亡率檢測:收集細胞,預冷 PBS 漂洗,加入結合緩沖液重懸,加入膜聯(lián)蛋白Ⅴ異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI)混勻后避光孵育10 min,細胞凋亡率使用流式細胞儀進行檢測。每組設3個復孔,實驗重復3次。乳酸脫氫酶(LDH)釋放率檢測:收集培養(yǎng)基上清和細胞,用含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,將靶細胞調(diào)整到5×104～2×105個/ml,根據(jù)說明書進行LDH釋放量檢測。LDH釋放率(%)=LDH上清/(LDH 上清+ LDH 細胞)×100%。

1.9磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路蛋白表達檢測 使用Western印跡檢測,取轉(zhuǎn)染2 d的腦微血管組織細胞,放入RIPA裂解液,等待30 min,4 ℃環(huán)境下2 500 r/min離心15 min,集上清,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度,將蛋白樣品和上樣緩沖液混合,100 ℃變性5 min,加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上樣孔中,每孔30 μl,濃縮膠電壓60 V,分離膠120 V,結束后取凝膠,4 ℃轉(zhuǎn)膜1.5 h,用5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h,加入PI3K、Akt、p-Akt一抗,放置一夜,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗膜后加入羊抗兔IgG,37 ℃育2 h后加入電化學發(fā)光(ECL)顯影,以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1miR-150-5p轉(zhuǎn)染效率鑒定 與正常組(1.00±0.07)、模型組(0.45±0.04)相比,上調(diào)組miR-150-5p表達量(2.86±0.03)顯著升高,下調(diào)組miR-150-5p表達量(0.23±0.02)顯著降低(P<0.05),證明miR-150-5p轉(zhuǎn)染成功。

2.2病理組織學觀察 如圖1所示,HE染色結果顯示,正常組內(nèi)皮細胞為長棍形,排列不規(guī)則,核淡,胞膜明顯;模型組細胞胞體變細、變小,部分損傷細胞縮小或變圓。上調(diào)組內(nèi)皮細胞明顯接近正常組,下調(diào)組內(nèi)皮細胞胞體縮小,損傷嚴重。

圖1 各組海馬區(qū)組織(HE染色,×400)

2.3各組氧化應激指標水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組及下調(diào)組MDA水平升高、SOD水平降低,上調(diào)組MDA水平降低,SOD水平升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,下調(diào)組MDA水平升高,SOD水平降低,上調(diào)組MDA水平降低,SOD水平升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組MDA水平升高,SOD水平降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表1 各組氧化應激指標、內(nèi)皮細胞凋亡率、LDH釋放率和PI3K/Akt 信號通路蛋白水平比較

2.4各組腦微血管內(nèi)皮細胞凋亡率和LDH釋放率比較 如表1所示,與正常組相比,模型組及下調(diào)組細胞凋亡率、LDH釋放率升高,上調(diào)組細胞凋亡率、LDH釋放率降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組相比,下調(diào)組細胞凋亡率、LDH釋放率升高,上調(diào)組細胞凋亡率、LDH釋放率降低,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組細胞凋亡率、LDH釋放率升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.5腦組織PI3K/Akt 信號通路蛋白表達 如表1、圖2所示,與正常組相比,模型組及下調(diào)組PI3K、Akt、p-PI3K含量降低,上調(diào)組PI3K、Akt、p-PI3K含量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組PI3K、Akt、p-PI3K 含量升高,下調(diào)組PI3K、Akt、p-PI3K含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組PI3K、Akt、p-PI3K含量顯著降低(P<0.05)。

圖2 Western印跡檢測腦組織PI3K/Akt信號通路蛋白表達

3 討 論

CSVD是一組腦部小血管病變導致的臨床、影像學、病理表現(xiàn)和認知改變的綜合征。腦小血管病凋亡的重要原因是腦微血管內(nèi)皮細胞具有合成、分泌、代謝和免疫等復雜功能〔5,6〕。其細胞間緊密連接、細胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及窗口缺乏等因素,使其在腦組織和血液之間的物質(zhì)交換中發(fā)揮關鍵作用,保持大腦環(huán)境的穩(wěn)定〔7〕。其功能結構在腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展等過程中起重要作用〔8〕。因此,保護微血管內(nèi)皮細胞免受損傷,對CSVD治療具有重要意義。

miR-150-5p表達水平可能與大鼠腦出血有關,升高其表達量可以減少其腦組織的損傷。miRNA是長度在21～25 nt的非編碼單鏈小分子RNA,在真核細胞中廣泛存在〔9,10〕。其中miR-150-5p是相對研究最早的miRNA,研究表明,在很多癌組織中miR-150-5p表達上調(diào),能夠明顯抑制細胞的損傷凋亡〔11,12〕。隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)miR-150-5p參與細胞的凋亡、分化、增殖等生物學過程〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-150-5p可以抑制腦微血管內(nèi)皮細胞的凋亡,減輕CSVD患者的臨床癥狀。

造成腦微血管內(nèi)皮細胞損傷主要的原因為氧化應激反應。對治療CSVD具有重要意義〔14〕。而MDA、SOD則是氧化反應的重要標志物,MDA水平升高證明了氧化應激損傷比較嚴重,相反MDA水平降低則表明氧化應激影響的程度減輕〔15,16〕。SOD可以將細胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)清除掉,在維持細胞氧化及抗氧化方面起重要作用。已有研究證實,細胞內(nèi)活性氧的增加可能會降低細胞生存率,導致細胞凋亡的增加〔17,18〕。本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-150-5p水平能有效減輕氧化應激損傷。

導致細胞凋亡的機制很多并且很復雜,B細胞淋巴瘤(Bcl)-2家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl和促凋亡蛋白Bcl-2相關X基因(Bax)、Bcl-2拮抗因子(Bak)兩大類,是內(nèi)源性凋亡途徑相關蛋白,可將外界刺激信號傳至線粒體,致使細胞凋亡,研究發(fā)現(xiàn)miR-150-5p可以通過信號傳導途徑PI3K/Akt來調(diào)節(jié)細胞活性和細胞凋亡〔19〕。本研究也證明,miR-150-5p可通過PI3K/Akt通路增加細胞活性,從而減少細胞的損傷凋亡。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑。PI3K/Akt信號系統(tǒng)在多種細胞中廣泛分布,PI3K通過磷脂酰肌醇環(huán)上3-羥脯氨酸氧化,生成磷酸化鉀,與Akt的pH區(qū)域結合,使Akt從細胞質(zhì)分離成細胞膜,使結構發(fā)生變化,然后通過影響后續(xù)效應分子的激活狀態(tài),在內(nèi)皮細胞凋亡中起關鍵作用〔20〕。PI3K/Akt信號通路可以調(diào)控細胞的增長、增生、黏附等多種生物學功能。PI3K被激活后,可募集并激活Akt,Akt被激活后可抑制下游靶蛋白表達,從而進行調(diào)節(jié)細胞的增生及凋亡過程〔21〕。根據(jù)上述結果,本研究認為上調(diào)miR-150-5p可影響CSVD大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞凋亡,可能與PI3K/Akt信號通路相關,但其機制還需進一步研究。