劉艷嬌 張倩 何龍英 張興隆

(邯鄲市第一醫(yī)院,河北 邯鄲 056002)

食管癌死亡率高居全球第6,在我國,食管癌發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第5位〔1,2〕。目前臨床上對于食管癌的治療方法包括采用外科手術(shù)、內(nèi)鏡、化療及放化療等,手術(shù)治療時首選方法,但是治療效果較差,主要是應(yīng)為腫瘤的局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且術(shù)后患者機(jī)體免疫能力降低〔3,4〕。p16是繼p53后近年來發(fā)現(xiàn)的又一個抑癌基因,又稱為多腫瘤抑制基因,可對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控,是cyclin-CDK復(fù)合物的特異性抑制劑〔5〕。肽?；彼崦搧啺访?PADI)4屬于表觀遺傳調(diào)控因子,研究發(fā)現(xiàn)其在惡性腫瘤患者血漿中表達(dá)水平增加,且對抑癌基因p53調(diào)控的下游基因具有抑制作用,從而破壞細(xì)胞增殖和凋亡,有可能是腫瘤易感基因,但是其在食管癌中的作用尚未有報道〔6,7〕。本研究探討p16、PADI4在食管癌組織中的表達(dá)及其與放射治療后預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1基本資料 選取58例邯鄲市第一醫(yī)院于2016年12月至2017年8月收治的接受放射治療的食管癌患者,男33例,女25例,平均年齡(59.03±8.33)歲。病變長度:10例>5 cm,33例3～5 cm,15例<3 cm。TNM分期〔8〕:Ⅰ～Ⅱ期38例,Ⅲ～Ⅳ期20例。食管鱗癌樣本離體30 min內(nèi),迅速切取食管鱗癌組織和配對的癌旁正常組織(距病變部5～10 cm以上),放入提前加入RNA保護(hù)液的凍存管中并標(biāo)記臨床病理信息,置入-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2p16和PADI4表達(dá)水平的測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法進(jìn)行測定。將組織置于液氮中充分研磨后,用TRIzol法提取組織細(xì)胞中總的RNA,參照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并對p16和PADI4(大連寶生物公司) 進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH(大連寶生物公司)為內(nèi)參,p16、PADI4及GAPDH引物序列如下:p16上游引物:5′-TGGCTCTGACCATTCTGT-3′,下游:5′-AGCTTTGGA AGCTCTCAG-3′,產(chǎn)物長度522 bp;PADI4上游引物:5′-GGTGTACGCGTGCAGTATTT-3′,下游:5′-TT CATCCTGCATCCACTGGT-3′,產(chǎn)物長度133 bp;GAPDH上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,產(chǎn)物長度452 bp。PCR條件為:95 ℃ 10 s,60 ℃ 32 s,進(jìn)行40個循環(huán)。采用相對定量法對qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行計算,相對表達(dá)量的計算公式=2-ΔΔCt。

1.3放療方法 采用三維適形放療。采用螺旋CT對全部食管進(jìn)行連續(xù)掃描,根據(jù)食管鏡、食管造影和CT勾畫出靶區(qū)GTV,并左右外擴(kuò)5～10 mm、上下外擴(kuò)30 mm,形成CTV,同時對心臟、肺和脊髓進(jìn)行勾畫。照射劑量為50～66 Gy,每次2 Gy,5次/w,并進(jìn)行5～6 w。雙肺V20>25%,心臟V40<45%,脊髓>45 Gy。

1.4臨床療效評估標(biāo)準(zhǔn)〔9〕所有靶病灶均無動脈期增強(qiáng)表示完全緩解(CR);靶病灶增強(qiáng)掃描動脈期的直徑總和≥30%表示部分緩解(PR);靶病灶增強(qiáng)掃描動脈期直徑增加≥20%表示疾病進(jìn)展(PD),靶病灶增大程度未達(dá)到PD標(biāo)準(zhǔn),靶病灶縮小程度未達(dá)到PR標(biāo)準(zhǔn)表示疾病穩(wěn)定(SD)。腫瘤體積無縮小或有新的病灶出現(xiàn)表示無效(NC)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗、F檢驗、χ2檢驗、Pearson相關(guān)系數(shù)法、K-M生存函數(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1癌組織和癌旁組織中p16和PADI4的表達(dá)水平比較 與癌旁組織相比,癌組織中p16表達(dá)水平明顯較低,癌組織中PADI4表達(dá)水平明顯較高(均P<0.001)。癌組織中p16表達(dá)水平與PADI4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.874,P<0.001)。見表1。

表1 癌組織和癌旁組織中p16和PADI4表達(dá)水平比較

2.2放療不同敏感性患者癌組織中p16和PADI4表達(dá)水平比較 58例食管癌患者放射治療后,21例患者CR,33例患者PR,4例患者NC。放療不同敏感性患者癌組織中p16和PADI4表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CR組癌組織中p16表達(dá)水平顯著高于CR組和NC組(P<0.05),PR組癌組織中p16表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05)。CR組癌組織中PADI4表達(dá)水平顯著低于PR和NC組(P<0.05),PR組癌組織中PADI4表達(dá)水平顯著低于NC(P<0.05)。見表2。

表2 放療不同敏感性患者癌組織中p16和PADI4表達(dá)水平

2.3p16和PADI4表達(dá)水平與患者臨床病理特征相關(guān)性分析 食管癌患者癌組織中p16和PADI4表達(dá)水平與TNM分期、浸潤程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 p16和PADI4表達(dá)水平與食管癌患者臨床病理特征相關(guān)性

2.4p16和PADI4表達(dá)水平與放射治療后預(yù)后的關(guān)系 對58例食管癌患者隨訪3年,死亡28例,存活30例,3年生存率為51.72%。其中 p16高表達(dá)組3年存活率為62.86%,p16低表達(dá)組3年存活率為34.78%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.381,P=0.036)。PADI4高表達(dá)和低表達(dá)組3年生存率分別為35.71%和66.67%,差異顯著(χ2=5.557,P=0.001 8)。生存曲線見圖1。

圖1 放療后食管癌患者K-M生存曲線

3 討 論

近年來我國食管癌的發(fā)病率逐年增加,是惡性度最高的惡性腫瘤之一,具有較強(qiáng)的侵襲性,即使根除后仍具有較高的復(fù)發(fā)率,5年的生存率僅為15%～20%,造成食管癌治療失敗的主要原因是抗敏感性細(xì)胞進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及對放療敏感性較差〔10,11〕。

P16的構(gòu)成含有148個氨基酸,是近年來發(fā)現(xiàn)的又一個抑癌基因,位于9號染色體,其編碼的產(chǎn)物是含有4個獨特的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)〔12〕。在腫瘤的發(fā)展過程中會使p16發(fā)生突變、甲基化及缺失,致使其失去活性,進(jìn)而引起腫瘤發(fā)生〔13〕。Mathew等〔14〕研究結(jié)果顯示,p16的缺失與遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移及食管癌的病理分期具有一定的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),提示p16表達(dá)水平可能與食管癌惡性程度有關(guān)。

PADI4屬于表觀遺傳調(diào)控因子,表觀遺傳調(diào)控因子廣義上講包括組蛋白修飾酶或去修飾酶,DNA甲基化酶,新出現(xiàn)的非編碼RNA及識別修飾的識別子,大量研究證實他們在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的參與作用〔15,16〕。癌癥的基本機(jī)制即是由表觀遺傳調(diào)節(jié)因子異常改變造成的表觀遺傳基因組的破壞,因此表觀遺傳調(diào)控是腫瘤生物學(xué)研究的重要熱點〔17,18〕。表觀遺傳因子可通過對靶基因的表達(dá)促進(jìn)或抑制而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物的表達(dá)如會造成其分化阻滯、惡性自我更新、組織侵襲及逃避細(xì)胞死亡等〔19〕。以往研究發(fā)現(xiàn),PADI4在前列腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌及十二指腸癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中都有參與,且PADI4與食管鱗癌的病理分期具有相關(guān)性〔20,21〕。P53是一種抑癌基因,可對靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化起到抑制作用,調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡。已有研究報道PADI4對p53的下游基因p21、WAF1等基因具有抑制作用,從而擾亂細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期,說明PADI4在惡性腫瘤的發(fā)病過程中具有非常重要的作用〔22,23〕。

本研究結(jié)果提示,p16和PADI4在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有協(xié)同作用,共同參與食管癌的發(fā)生發(fā)展過程。