趙 達 包利利 王曉黎 李 波

卵巢早衰是指女性在40歲前喪失卵巢功能的現(xiàn)象,患者表現(xiàn)為血促性腺激素水平異常升高以及雌激素水平異常降低等卵巢內分泌功能異常情況[1]。卵巢早衰后卵巢顆粒細胞凋亡異常導致,其具體原因還有待于研究[2]。目前對于癥狀明顯者多采取雌激素補充治療,但長期大量雌激素治療存在乳腺癌或心血管事件的風險[3～7]。

來源于脂肪的干細胞除具有自我更新、高增殖率和多分化能力外,還具有來源豐富且無論理學爭議的特點[8～10]。既往研究顯示,脂肪間充質干細胞能對模型動物心臟病、腦梗死、肝硬化、骨關節(jié)炎等治療效果明顯[11～14]。還有研究認為干細胞對長期不孕和卵巢損傷有治療作用[15,16]。因而本實驗通過2020年1～12月在海南省婦女兒童醫(yī)學中心進行實驗,擬探討脂肪間充質干細胞對卵巢早衰模型小鼠卵巢內分泌功能及顆粒細胞凋亡的影響。

材料與方法

1.材料:實驗于2020年1～12月在海南省婦女兒童醫(yī)學中心完成。實驗動物:無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級昆明種小鼠1只,鼠齡2周; SPF級雌性昆明種小鼠36只,鼠齡6周,由海南省醫(yī)學實驗動物中心提供,動物許可證號:SYXK(瓊)2017-0014。給予全價營養(yǎng)飼料,保持室溫為21℃～25℃,在相對濕度50%～ 70%的條件下,每天光照12h,自由飲食水。實驗方案經海南省婦女兒童醫(yī)學中心動物倫理學委員會批準,批準號為HNLL20190501DL03。

2.主要試劑及儀器:DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、蛋白酶K購自美國Sigma公司;環(huán)磷酰胺購自美國Hyclone公司;茜素紅、油紅O、環(huán)磷酰胺、白消安、血清雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢驗試劑盒、TUNEL染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司。

3.隨機對照動物實驗:36只小鼠適應性喂養(yǎng)1周,實驗前進行小鼠陰道脫落細胞涂片,將動情周期正常小鼠全部納入實驗。(1)脂肪間充質干細胞的分離、培養(yǎng)以及鑒定:取2周齡小鼠,斷頸處死,體積分數(shù)75%乙醇浸泡10min,提取兩側腹股溝處脂肪組織,磷酸緩沖液(phosphate buffer;PBS)洗3次,剪碎脂肪組織,0.25%的Ⅰ型膠原酶37℃消化40min,離心5min,去上清,以含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM重懸,以4×104/cm2重新接種,37℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)3天,全量換液,以后每3或4天換液1次,細胞融合70%～80%時,以0.25%胰酶消化,按1∶3傳代。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取第3代脂肪間充質干細胞進行后續(xù)研究。取第3代脂肪間充質干細胞,以0.25%胰酶消化,PBS洗滌,調整細胞濃度為5×109/L時,加入熒光抗體4℃避光孵育30～45min;PBS洗,離心,PBS重懸,流式細胞儀檢測細胞表面標志物。取第3代脂肪間充質干細胞,以0.25%胰酶消化,調整細胞濃度為1×109/L,以成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,茜素紅染色,倒置顯微鏡觀察。取第3代脂肪間充質干細胞,以0.25%胰酶消化,調整細胞濃度為1×109/L,以成脂誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,油紅O染色,倒置顯微鏡觀察[17]。(2)實驗動物分組:將昆明種小鼠隨機分為假手術組、卵巢早衰組以及脂肪間充質干細胞組,各12只。(3)卵巢早衰模型的建立:卵巢早衰組以及脂肪間充質干細胞組昆明種小鼠腹腔注射1次環(huán)磷酰胺120mg/kg以及白消安12mg/kg,每天以棉簽輕取陰道分泌物涂片,巴氏染色,觀察陰道脫落細胞變化。當持續(xù)10天或10天以上動情間期,認為成功建立卵巢早衰模型[18～20]。假手術組注射0.9%氯化鈉溶液。假手術組動物的標準是保持原來的動情周期不變,即動情周期為4～6天。(4)脂肪間充質干細胞移植治療:造模成功后第1天起每7天,脂肪間充質干細胞組經尾靜脈注射1ml濃度為1×109/L脂肪間充質干細胞懸液,共注射4次。假手術組和卵巢早衰組注射1ml0.9%氯化鈉溶液。(5)卵巢內分泌功能鑒定:造模前1天以及造模成功后14、28天,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠,取腹主動脈血1ml,靜置后以2000r/min離心,取血清,-80℃低溫保存,以ELISA法檢測血清雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B濃度。酶標儀檢測450nm處吸光度值,建立標準曲線,計算樣本濃度。(6)取材:造模成功后28天,頸椎脫臼法處死小鼠,取雙側卵巢,40g/L多聚甲醛固定,石蠟包埋,行5μm厚切片。(7)蘇木精-伊紅染色檢測卵巢病理變化:取小鼠卵巢石蠟切片,二甲苯孵育,梯度乙醇復水,蘇木精染色,鹽酸乙醇洗,伊紅復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,光鏡觀察。(8)Tunel染色檢測卵巢顆粒細胞的凋亡:二甲苯孵育,梯度乙醇復水,蛋白酶K室溫水解,過氧化氫室溫孵育, 末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)37℃染色1h,終止劑終止反應,37℃孵育30min,過氧化物酶標記的抗地高辛抗體濕盒室溫染色30min,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)顯色,甲基綠復染,光鏡觀察卵巢顆粒細胞的凋亡情況。每張切片隨機取3個400視野,記錄凋亡細胞數(shù)量與總細胞數(shù)量,凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量×100%。(9)主要觀察指標:卵巢病理變化、內分泌功能以及卵巢顆粒細胞凋亡情況。

圖1 脂肪間充質干細胞的結果A.培養(yǎng)脂肪間充質干細胞的形態(tài)(×200),細胞呈梭型;B.成骨誘導后茜素紅染色的結果(×200),箭頭指示鈣結節(jié);C.成脂誘導后油紅O染色的結果(×200),箭頭指示橘紅色脂滴。結果證實培養(yǎng)的細胞符合脂肪間充質干細胞的特性;D.流式細胞儀的結果

圖2 脂肪間充質干細胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢病理損傷的影響(蘇木精-伊紅染色,×200)A.假手術組,卵巢組織形態(tài)結構正常;B.卵巢早衰組,卵巢卵泡數(shù)量減少,淋巴細胞浸潤;C.脂肪間充質干細胞組,卵巢萎縮、卵泡數(shù)量異常、透明帶形態(tài)以及淋巴細胞浸潤明顯減輕

圖3 脂肪間充質干細胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢中顆粒細胞凋亡的影響(Tunel染色)A.假手術組;B.卵巢早衰組;C.脂肪間充質干細胞組卵巢中凋亡的顆粒細胞(×200)。其中卵巢早衰模型小鼠可見較多的顆粒細胞,而假手術組以及脂肪間充質干細胞組顆粒細胞數(shù)量較少;D.卵巢中凋亡的顆粒細胞的數(shù)量。與假手術組比較,*P<0.05;與卵巢早衰組比較,#P<0.05

結 果

1.脂肪間充質干細胞的培養(yǎng)與鑒定結果:所有培養(yǎng)的脂肪間充質干細胞在接種后24h貼壁,細胞呈梭形。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細胞表面標志物CD29陽性率為99.9%,CD34陽性率為2.1%,CD45陽性率為2.8%,且經成骨誘導3周后,茜素紅染色可見細胞中存在深紅色鈣結節(jié);而經成脂誘導3周,油紅O染色可見細胞中存在橘紅色脂滴,說明培養(yǎng)的細胞為脂肪間充質干細胞,詳見圖1。

2.實驗動物數(shù)量分析:卵巢早衰組及脂肪間充質干細胞組動物均造模成功,所有36只小鼠均完成全部實驗,所有數(shù)據(jù)均進入結果分析,無脫失。

3.脂肪間充質干細胞移植治療改善卵巢早衰模型小鼠卵巢的內分泌功能:造模前1天,各組小鼠血清雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B濃度接近(P>0.05)。造模成功后14天時,與假手術組比較,卵巢早衰組以及脂肪間充質干細胞組血清雌二醇、孕酮以及抑制素B濃度明顯減少(P<0.05),而促卵泡生成素和黃體生成素濃度顯著增加(P<0.05),且卵巢早衰組以及脂肪間充質干細胞組上述指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模成功后28天時,與卵巢早衰組比較,脂肪間充質干細胞組血清雌二醇、孕酮以及抑制素B濃度明顯增加(P<0.05),而促卵泡生成素和黃體生成素濃度減少(P<0.05),詳見表1。

表1 脂肪間充質干細胞移植對卵巢早衰模型小鼠卵巢內分泌功能的影響

4.脂肪間充質干細胞移植治療改善卵巢早衰模型小鼠卵巢病理損傷:蘇木精-伊紅染色結果顯示,假手術組小鼠卵巢明顯變相異常變化;卵巢早衰模型小鼠卵巢明顯萎縮,卵泡數(shù)量減少,透明帶形態(tài)異常,可見淋巴細胞浸潤;而經脂肪間充質干細胞移植治療后,上述病理變化明顯減輕,詳見圖2。

5.脂肪間充質干細胞移植治療減少卵巢早衰模型小鼠卵巢中顆粒細胞的凋亡:Tunel染色結果顯示,假手術組小鼠卵巢中未見凋亡的顆粒細胞,而卵巢早衰模型小鼠卵巢中可見大量凋亡的顆粒細胞,而經脂肪間充質干細胞移植治療后,模型小鼠卵巢中凋亡的顆粒細胞數(shù)量明顯減少(P<0.05),詳見圖3。

討 論

卵巢早衰是一種婦科常見病,會出現(xiàn)多種生殖激素表達異常的現(xiàn)象,同時病理學研究也證實患者的卵巢結構也發(fā)生明顯改變[21]。卵泡是卵母細胞發(fā)生與發(fā)育的基本單位,是卵巢結構和功能的核心,而顆粒細胞是組成卵泡的重要細胞之一,對卵母細胞發(fā)育至關重要。卵巢早衰患者除卵母細胞往往呈現(xiàn)發(fā)育不良,甚至退化,且其顆粒細胞數(shù)量也比正常人群明顯減少[1]。本實驗發(fā)現(xiàn),經誘導的卵巢早衰模型小鼠的卵巢發(fā)生明顯病理損傷,其卵巢明顯萎縮,卵泡數(shù)量減少,透明帶形態(tài)異常,可見淋巴細胞浸潤以及大量凋亡的顆粒細胞,同時小鼠血清中的雌二醇、孕酮、促卵泡生成素、黃體生成素以及抑制素B均發(fā)生明顯變化,與既往研究結果一致。

脂肪間充質干細胞具有增殖力強以及多向分化潛力,同時還能夠分泌多種細胞因子促進損傷組織的修復[8～10]。本實驗獲得的脂肪間充質干細胞形態(tài)、表面標志物以及分化能力均符合間充質干細胞的特征。且卵巢早衰模型小鼠經過4次脂肪間充質干細胞移植治療后,其病理損傷明顯減輕,同時顆粒細胞數(shù)量有所恢復,且小鼠血清雌二醇、孕酮以及抑制素B濃度明顯增加,促卵泡生成素和黃體生成素濃度減少,但上述指標與假手術組比較,差異有統(tǒng)計學意義。

實驗結果證實,脂肪間充質干細胞通過改善卵巢早衰模型小鼠卵巢內分泌功能,減少顆粒細胞凋亡,對卵巢早衰具有治療作用。實驗僅對卵巢早衰模型小鼠進行了28天的觀察,尚不清楚脂肪間充質干細胞對卵巢早衰的遠期影響。同時由于脂肪間充質干細胞產生的影響可能由于其分泌的細胞因子所導致。