朱世茂 李惠武 劉 玲 楊銀銀 海妮薩依姆·圖爾蓀 李 卉

Survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族成員,由 BIRC5 基因編碼,位于人染色體17q25號(hào)位置[1]。Survivin在細(xì)胞中發(fā)揮多種功能,如調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂,抑制凋亡,促血管生成,可以作為腫瘤免疫治療抗原等[2]。Survivin在幾乎所有人類腫瘤中高表達(dá),如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胃癌等,但在分化成熟的正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)[3,4]。其在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中差異表達(dá)的特點(diǎn)使Survivin成為癌癥治療的一個(gè)極具吸引力的靶點(diǎn)[5]。

圖2 RAPA作用于細(xì)胞后的自噬體數(shù)的變化A.對(duì)照組;B.PAPA組

圖3 YM155作用Eca109細(xì)胞后ATG16L1mRN和Survivin mRNA表達(dá)A.ATG16L1的mRNA表達(dá)變化;B.Survivin的mRNA表達(dá)變化

當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞內(nèi)外因素如饑餓、缺氧、小分子化合物、氧化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和病原體入侵等刺激時(shí),會(huì)誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生[6～8]。自噬啟動(dòng)以后,在延伸階段需要兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)參與膜延伸擴(kuò)張,即泛素樣蛋白ATG12-ATG5-ATG16L1系統(tǒng)和LC3/Atg8家族蛋白(包括 LC3 和 GABARAP 亞家族)[9]。其中自噬相關(guān)蛋白ATG16L1在兩個(gè)泛素樣蛋白系統(tǒng)都中起著至關(guān)重要作用,同時(shí)在自噬的不同階段具有不同的功能,是自噬相關(guān)蛋白中一個(gè)關(guān)鍵參與者[10]。

食管癌是最常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一,Survivin在包括食管癌在內(nèi)的大多數(shù)人類腫瘤的致癌作用中起重要作用[11]。自噬是目前腫瘤研究的熱點(diǎn),自噬的增加和減少參與了癌癥、神經(jīng)性、自身免疫性疾病和感染等疾病的病理過(guò)程[12]。ATG16L1在自噬中起主要作用,其在自噬體的形成過(guò)程中充當(dāng)分子支架介導(dǎo)蛋白間的相互作用[13]。因此,在研究腫瘤細(xì)胞自噬的過(guò)程中,Survivin和ATG16L1兩者之間的關(guān)系值得深入探討,可為進(jìn)一步揭示靶向Survivin臨床治療癌癥的作用機(jī)制提供理論參考。

材料與方法

1.細(xì)胞系和主要試劑:食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司,磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,兔抗人ATG16L1抗體、兔抗人Survivin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司、兔抗人p62等抗體購(gòu)自武漢博士德公司、雷帕霉素購(gòu)自美國(guó)Selleck公司,山羊抗兔IgG、鼠抗β-actin抗體購(gòu)自上海中杉金橋公司、TaKaRa試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連TaKaRa公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染:人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞復(fù)蘇后在37℃、5% CO2條件的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(control組)、RAPA誘導(dǎo)組、陰性對(duì)照組(包括negative control、siNC和RAPA+negative control、RAPA+siNC)和Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染組(包括Survivin-siRNA和RAPA+Survivin-siRNA),RAPA工作濃度均為50nmol/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Eca109 細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染條件:電壓 280V,電阻 550Ω,電容 900F,之后接種于 6 孔板中,每孔加入2ml培養(yǎng)基。在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后收取細(xì)胞。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)基因的mRNA水平表達(dá):Trizol法提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定RNA的純度和濃度。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行定量,最后根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。生工生物工程(上海)股份有限公司合成所需引物,引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

4.Western blot法檢測(cè)蛋白水平表達(dá):采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取, BCA法進(jìn)行總蛋白濃度的測(cè)定。將總蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉液室溫1h,單克隆抗體一抗(稀釋比例1∶1000)孵育,4℃搖床過(guò)夜。孵育結(jié)束后,將條帶放入洗膜盒中,盒中提前加入1×TBST洗膜液,洗3次,10分鐘/次。室溫孵育二抗(山羊抗兔1∶5000,山羊抗鼠1∶20000)1h。洗滌之后用ECL顯影試劑顯色。Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

5.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):具體檢測(cè)方法參考碧云天的雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)操作手冊(cè)。主要步驟是將Survivin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和p62雙報(bào)告基因質(zhì)粒(包括內(nèi)參照海腎質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染24h后,使用PBS洗細(xì)胞1次,根據(jù)說(shuō)明加入細(xì)胞裂解液,室溫裂解細(xì)胞15min,吸取100μl細(xì)胞裂解液,放入專用的96孔板,加入100μl恢復(fù)到室溫的螢火蟲(chóng)熒光素酶工作液,使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè);孔中添加100μl配制好的1×海腎熒光素酶工作液,使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè),最后對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

6.細(xì)胞免疫熒光觀察自噬體數(shù)目:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞,消化成懸液后接種于6孔板內(nèi)的玻璃爬片上,待細(xì)胞貼壁后,用濃度為50nmol/L的雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞,以未做處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。加入磷酸緩沖鹽溶液液清洗并棄掉洗液,用4%多聚甲醛室溫固定15min后用磷酸緩沖鹽溶液清洗3次,10分鐘/次。一抗(1∶200)室溫、黑色濕盒封閉1h,然后洗滌3次,10分鐘/次。使用熒光二抗室溫、黑色濕盒孵育1h,然后洗滌3次,10分鐘/次。最后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集圖片。

結(jié) 果

1.RAPA誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞后檢測(cè)p62和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá):使用RAPA誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞后,Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RAPA組中LC3-Ⅱ的表達(dá)升高(圖1A),p62蛋白表達(dá)水平降低(圖1B),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),自噬體數(shù)目(紅色光點(diǎn))增多(圖2)。提示在Eca109細(xì)胞中RAPA誘導(dǎo)建立自噬模型。

2.YM155作用Eca109細(xì)胞自噬模型后檢測(cè)ATG16L1和Survivin的 mRNA水平表達(dá):使用Survivin特異性抑制劑YM155干預(yù)Eca109細(xì)胞自噬模型24h后,RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RAPA組中ATG16L1mRNA的表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖3A),Survivin mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3B);與RAPA組比較,RAPA+YM155組中Survivin和ATG16L1的mRNA 表達(dá)均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3,P<0.05)。

3.YM155作用Eca109細(xì)胞后檢測(cè)ATG16L1和Survivin的蛋白表達(dá)變化:使用Survivin特異性抑制劑YM155干預(yù)Eca109細(xì)胞與細(xì)胞自噬模型24h后,Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RAPA組中ATG16L的蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Survivin的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與RAPA組比較,RAPA+YM155組ATG16L1和Survivin的蛋白表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

圖4 YM155作用于Eca109細(xì)胞后ATG16L1和Survivin的蛋白表達(dá)*P<0.01; **P<0.001

4.Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后檢測(cè)Survivin和ATG16L1的mRNA水平表達(dá):Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染24h后,RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RAPA組中ATG16L1mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.01,圖5A),Survivin mRNA的表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05,圖5B);與RAPA組比較,RAPA+Survivin-siRNA組中ATG16L1 和Survivin的mRNA表達(dá)均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01,圖5)。

5.Survivin-siRNA作用Eca109細(xì)胞后檢測(cè)ATG16L1和Survivin的蛋白表達(dá):Western blot法結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RAPA組中Survivin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),ATG16L1的蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01);與RAPA誘導(dǎo)組比較,RAPA+Survivin-siRNA組中Survivin和ATG16L1的蛋白表達(dá)降低(P<0.001,圖6)。

圖6 survivin-siRNA作用于Eca109細(xì)胞后Survivin和ATG16L1蛋白表達(dá)水平變化*P<0.01,**P<0.001

圖7 過(guò)表達(dá)Survivin對(duì)p62的影響A.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)Survivin后細(xì)胞中p62的熒光素酶活性;B.過(guò)表達(dá)Survivin后p62蛋白表達(dá)。*P<0.01,**P<0.001

6.過(guò)表達(dá)Survivin對(duì)p62的影響:雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,在 Eca109 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Survivin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后,與pGL3-p62 promoter組比較,pGL3-p62 promoter+SVVcDNA組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001,圖7A);Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)Survivin后,Survivin表達(dá)量明顯上升,p62的表達(dá)量明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01,圖7B)。

討 論

食管癌是最常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一,全球食管癌發(fā)生率和病死率分別位居第7位和第6位[14]。食管癌的兩種主要組織學(xué)亞型是鱗狀細(xì)胞癌和腺癌[15]。食管鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的重要亞型,由于缺乏早期檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌的靈敏方法,許多患者在診斷時(shí)已有鄰近浸潤(rùn)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[16]。盡管目前手術(shù)和放化療水平都有很大進(jìn)步,但食管鱗癌患者的預(yù)后相對(duì)較差,存活率普遍較低[11]。

在細(xì)胞自噬的研究中,mTOR蛋白特異性抑制劑雷帕霉素可以激活自噬,是一種常用的自噬誘導(dǎo)劑,常用來(lái)構(gòu)建細(xì)胞自噬陽(yáng)性模型[17,18]。LC3和p62都是檢測(cè)自噬活性的標(biāo)志性蛋白。在自噬過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)的LC3-Ⅰ型被脂化加工成為L(zhǎng)C3-Ⅱ型,并鑲嵌定位在在自噬體膜上,隨著自噬的進(jìn)展,自噬體增多,LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白轉(zhuǎn)換增加[19]。由于LC3-Ⅰ型比LC3-Ⅱ型更容易降解,因此最常見(jiàn)的方法是通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)LC3-Ⅱ型來(lái)衡量細(xì)胞的自噬活性,而自噬底物蛋白p62參與自噬體的降解過(guò)程,其表達(dá)量增加可抑制細(xì)胞自噬[20,21]。前期研究表明使用50nmol/L的雷帕霉素誘導(dǎo)Eca109 細(xì)胞后,利用射透電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察,可以成功建立細(xì)胞自噬模型[22]。本實(shí)驗(yàn)研究中使用RAPA誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞株Eca109后,Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RAPA誘導(dǎo)組中p62蛋白的表達(dá)水平降低,LC3-Ⅱ型蛋白的表達(dá)水平升高。表明RAPA誘導(dǎo)后細(xì)胞自噬增強(qiáng),成功建立細(xì)胞自噬模型。

自噬與腫瘤的進(jìn)展、治療以及預(yù)后關(guān)系密切。研究表明,Survivin能以不同于凋亡的方式幫助細(xì)胞逃避死亡,其中之一是操縱自噬,通過(guò)干擾自噬參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。它可與自噬中的不同自噬相關(guān)蛋白相互作用,研究證明 Beclin1 能夠與 Survivin 結(jié)合從而干預(yù)自噬。本研究中使用Survivin特異性抑制劑YM155和轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA干預(yù)食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞自噬模型后,PCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與RAPA組比較, RAPA誘導(dǎo)組使用抑制劑YM155和轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA 后,ATG16L1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低,表明RAPA誘導(dǎo)自噬蛋白ATG16L1表達(dá)升高的作用被抑制,Survivin的存在影響ATG16L1的表達(dá)。

p62是一個(gè)多功能的泛素化接頭蛋白,作為多功能信號(hào)樞紐,控制多種細(xì)胞過(guò)程,如在癌癥發(fā)展、炎癥和免疫、細(xì)胞分化和自噬等過(guò)程中的發(fā)揮至關(guān)重要[23]。在自噬途徑中,p62作為選擇性自噬受體和底物主要通過(guò)PB1、LIR和UBA 3種結(jié)構(gòu)域與自噬蛋白相互作用[24]。哺乳動(dòng)物內(nèi)的蛋白質(zhì)自噬性降解需要 LC3相互作用區(qū)域(LC3-interacting region,LIR)結(jié)構(gòu),p62通過(guò)LIR結(jié)構(gòu)域與LC3相互作用,促進(jìn)了自噬體結(jié)構(gòu)的形成[25]。本實(shí)驗(yàn)研究中雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,Survivin能夠抑制p62的啟動(dòng)子活性,Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Survivin后p62的蛋白表達(dá)降低,初步表明Survivin可能對(duì)p62基因有靶向調(diào)控作用。

綜上所述,在研究沉默食管癌細(xì)胞中Survivin基因?qū)ψ允上嚓P(guān)蛋白ATG16L1表達(dá)的影響過(guò)程中,在食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞中沉默Survivin后,自噬相關(guān)蛋白ATG16L1的表達(dá)下調(diào),推測(cè) Survivin調(diào)節(jié)ATG16L1的表達(dá)可能是通過(guò)Survivin靶向抑制p62完成的,只是分子間的作用關(guān)系有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為揭示Survivin基因在腫瘤細(xì)胞自噬發(fā)生中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。