張雙,李江林,趙瑞珍,張東樞,李驍群,唐啟盛

1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029

抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近年來(lái)抑郁癥炎癥假說(shuō)得到越來(lái)越多證據(jù)的支持,有望成為抑郁癥研究的突破點(diǎn)。研究表明,抑郁癥患者血液中白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ)等促炎因子水平明顯升高[1],而抗炎治療可以改善抑郁癥狀[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)是IL-1β成熟和釋放的誘導(dǎo)劑,同時(shí)是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的重要分子,NLRP3通過(guò)多種機(jī)制參與抑郁癥的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3基因敲除的小鼠經(jīng)4周慢性溫和應(yīng)激(chronic mild stress,CMS)無(wú)抑郁樣表現(xiàn),IL-1β和細(xì)胞焦亡執(zhí)行蛋白gasdermin D(GSDMD)水平未見(jiàn)升高[4],據(jù)此推測(cè)NLRP3介導(dǎo)的免疫通路在抑郁癥的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。

頤腦解郁方是唐啟盛教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié),臨床研究表明,頤腦解郁方起效快、安全性好[5-6],但頤腦解郁方是否通過(guò)抑制NLRP3的激活而產(chǎn)生抗抑郁作用仍然未知。因此,本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IFN-γ的表達(dá)情況以及腦組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白、GSDMD蛋白水平探索頤腦解郁方益腎調(diào)氣的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠32只,6周齡,體質(zhì)量為190 ～ 210 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(京)2020-0036。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,自由攝食和飲水,保持室溫(23±1) ℃,相對(duì)濕度60%～70%,光照周期晝夜各12 h(7：00～19：00光照;19：00至次日7：00黑暗),室內(nèi)安靜。本研究由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò),涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究?jī)?nèi)容和過(guò)程均符合國(guó)家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)要求,倫理編號(hào):BUCM-4-2021091308-3166。

1.2 藥物與試劑刺五加、梔子、五味子、郁金(配方顆粒劑,北京康仁堂藥業(yè)有限公司,批號(hào):20033601、20036651、20034601、20016081);鹽酸氟西汀膠囊(規(guī)格:每粒20 mg,禮來(lái)蘇州制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:J20170022)。全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預(yù)染蛋白分子量、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、Tris-甘氨酸蛋白電泳緩沖液、Western Blot檢測(cè)試劑盒、顯影定影試劑(江蘇凱基生物有限公司,批號(hào):KGP250、KGA902、KGP113、KGP441、KGP101、KGP103X、KGP1201、KGP116);大鼠IL-1β ELISA試劑盒(美國(guó)Proteintech公司,批號(hào):KE20005);大鼠IFN-γ ELISA試劑盒(美國(guó)Raybiotech公司,批號(hào):ELR-IFNg-1)。

1.3 儀器高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):Sorvall ST16R);熒光定量PCR循環(huán)儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào):Step one plus Real time-PCR system);微型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):Power Supplies Basic);紫外分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司,型號(hào):UV-2450);Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司,型號(hào):170-4150);凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司,型號(hào):ChemiDoc MP Imaging System);臺(tái)式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,型號(hào):THZ-312);脫色搖床(江蘇金壇市正基儀器廠,型號(hào):HY-4);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司,型號(hào):Spectramac M3);超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇州凈化公司,型號(hào):SW-CJ-1FD);敞箱(自制,型號(hào):80 cm×80 cm×40 cm)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與模型制備32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、頤腦解郁方組及鹽酸氟西汀組,每組8只。正常組不予干預(yù),常規(guī)飼養(yǎng),其余3組大鼠采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)法連續(xù)刺激21 d同時(shí)聯(lián)合孤養(yǎng)建立抑郁模型[7],即CUMS刺激時(shí)隨機(jī)選取7種應(yīng)激方法,包括:禁食24 h、禁水24 h、潮濕墊料24 h、夾尾1 min、4 ℃冰水游泳5 min,束縛2 h、晝夜顛倒,每種方法各應(yīng)用3次。具體安排如下:

2.2 給藥方法造模結(jié)束次日于行為學(xué)測(cè)試后,正常組、模型組、頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)。參考課題組前期方法和劑量對(duì)頤腦解郁方和鹽酸氟西汀組大鼠進(jìn)行灌胃[8],頤腦解郁方組大鼠每天給予6.2 g·kg-1頤腦解郁方溶液灌胃,鹽酸氟西汀組大鼠每天給予2.3 g·kg-1鹽酸氟西汀溶液灌胃,灌胃體積均為10 mL·kg-1,連續(xù)灌胃28 d,正常組與模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

2.3 行為學(xué)測(cè)試

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)采用自制黑色無(wú)蓋方箱,其底面用白線劃分為25個(gè)16 cm×16 cm方格。將大鼠置于箱子中央方格中,記錄大鼠3 min內(nèi)的活動(dòng)情況。觀察指標(biāo)包括活動(dòng)總路程、靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、水平運(yùn)動(dòng)得分及垂直運(yùn)動(dòng)得分,其中以大鼠穿越方格數(shù)(至少3爪進(jìn)入方格)為水平運(yùn)動(dòng)得分,每格得1分;以大鼠前兩肢直立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分,每直立1次得1分。每只測(cè)定結(jié)束后清理尿便并使用酒精消毒擦拭箱子內(nèi)部,避免氣味殘留。記錄造模前、造模后和干預(yù)28 d后各組大鼠的曠場(chǎng)得分情況。

2.3.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test,SPT)實(shí)驗(yàn)前3 d進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練,即第1天放2瓶均裝有1%的蔗糖水;第2天1瓶裝有1%的蔗糖水和1瓶純凈水,訓(xùn)練結(jié)束后禁食禁水12 h,再進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)。將1瓶100 mL的1%蔗糖水與1瓶100 mL純凈水置于鼠籠前,12 h后分別稱量瓶和水的質(zhì)量,記錄糖水和純凈水消耗量,得出大鼠糖水偏好率。造模前、造模后和干預(yù)28 d后各進(jìn)行1次,分別計(jì)算大鼠糖水偏好率。

糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純凈水消耗量)×100%

根據(jù)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和糖水偏好率篩選符合抑郁癥模型者進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)測(cè)試,每組保證6只。

2.4 ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清炎癥因子水平大鼠麻醉后,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,室溫下靜置30 min,3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm),取上清待測(cè)。參照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū),依步驟處理后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中IL-1β、IFN-γ的水平。

2.5 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠海馬及前額葉皮質(zhì)中NLRP3mRNA的水平按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腦組織總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度;取2 μg RNA行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;參考試劑盒行RT-PCR,PCR反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)條件為:95 ℃ 變性15 s、60 ℃退火 20 s、72 ℃ 延伸40 s,共 40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計(jì)算NLRP3基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 大鼠21 d CUMS法安排表

2.6 Western Blot檢測(cè)各組大鼠海馬及前額葉皮質(zhì)中NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)水平取出凍存的海馬及前額葉皮質(zhì)組織,分別加入組織裂解液,4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min后取上清液,BCA法檢測(cè)總蛋白濃度,沸水浴10 min使蛋白變性后分別取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,NC膜置于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h,滴加NLRP3(稀釋比例為1：1 000)、GSDMD(稀釋比例為1：2 000)、GAPDH(稀釋比例為 1：5 000)抗體后4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后滴加二抗(稀釋比例為1：5 000)室溫孵育2 h,洗膜后滴加ECL顯色,以目標(biāo)蛋白(NLRP3、GSDMD)條帶灰度值與內(nèi)參(GAPDH)條帶灰度值的比值計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠糖水偏好率變化比較造模前,各組大鼠糖水偏好率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后,與正常組比較,其余組大鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.05)。干預(yù)后,與正常組比較,模型組大鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.01);與模型組比較,頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠糖水偏好率均顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 頤腦解郁方對(duì)大鼠糖水偏好率的影響

3.2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較造模前,各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模結(jié)束后,與正常組比較,其余組大鼠活動(dòng)總路程顯著降低(P<0.05),運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.05),靜止時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05),水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著降低(P<0.05)。干預(yù)后,與正常組比較,模型組大鼠活動(dòng)總路程顯著降低(P<0.05),水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著降低(P<0.05);與模型組比較,頤腦解郁方組大鼠活動(dòng)總路程顯著延長(zhǎng)(P<0.01),運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05),靜止時(shí)間顯著減少(P<0.05),水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著升高(P<0.05);鹽酸氟西汀組大鼠活動(dòng)總路程顯著延長(zhǎng)(P<0.01),水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 頤腦解郁方對(duì)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)得分的影響

3.3 各組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平比較與正常組比較,模型組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ含量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,頤腦解郁方組與鹽酸氟西汀組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 頤腦解郁方對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響

3.4 各組大鼠海馬組織NLRP3mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)水平的比較與正常組比較,模型組大鼠海馬組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白以及GSDMD蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01);與模型組比較,頤腦解郁方組與鹽酸氟西汀組大鼠海馬組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白以及GSDMD蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)表6、圖1。

圖1 海馬中NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)條帶

表6 頤腦解郁方對(duì)大鼠海馬組織中NLRP3 mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)水平的影響

3.5 各組大鼠前額葉皮質(zhì)組織中NLRP3mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白的比較與正常組比較,模型組大鼠前額葉皮質(zhì)組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白和GSDMD蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,頤腦解郁方組與鹽酸氟西汀組大鼠前額葉皮質(zhì)組織中NLRP3mRNA和NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表7、圖2。

圖2 前額葉皮質(zhì)中NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)條帶

表7 頤腦解郁方對(duì)大鼠前額葉皮質(zhì)NLRP3 mRNA和NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

抑郁癥在中醫(yī)古籍中無(wú)相應(yīng)記載,根據(jù)其臨床表現(xiàn)特征,將其歸屬于中醫(yī)郁病、不寐、癲證、百合病、梅核氣等范疇[9]。課題組前期大樣本臨床研究發(fā)現(xiàn),腎虛肝郁證是抑郁癥中最常見(jiàn)的證候類型[10],在此基礎(chǔ)上唐啟盛教授提出益腎調(diào)氣法治療抑郁癥并總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)方——頤腦解郁方,該方由刺五加20 g,梔子10 g,五味子10 g,郁金10 g組成。唐啟盛教授認(rèn)為本病起于所愿不遂,致肝郁氣滯,肝失疏泄則胸脅脹滿、喜嘆息;病久及腎,耗損腎精腎氣,因腎主骨生髓,腎精腎氣耗損,則髓減腦消,腦之元神失養(yǎng),則出現(xiàn)情緒低落、思維遲緩、失眠、健忘等[11-12]。頤腦解郁方中重用刺五加以補(bǔ)腎安神;郁金疏肝解郁、行氣活血;五味子性溫味酸甘,可收斂固澀、補(bǔ)腎寧心;少佐梔子疏肝清郁熱以除煩[13]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),頤腦解郁方的組成藥物中含有多種有效活性成分,可通過(guò)抗炎、神經(jīng)保護(hù)機(jī)制產(chǎn)生抗抑郁作用[14-17]。

本研究采用CUMS抑郁模型模擬人類因長(zhǎng)期、慢性壓力導(dǎo)致的抑郁狀態(tài),其病理生理機(jī)制與人類抑郁癥的發(fā)病機(jī)制相似[18]。OFT和SPT是抑郁模型常用的行為學(xué)檢測(cè)方法,OFT用于評(píng)價(jià)抑郁動(dòng)物的自主活動(dòng)和探索行為,抑郁動(dòng)物的自主活動(dòng)和探索行為減少;SPT用于評(píng)價(jià)動(dòng)物的獎(jiǎng)賞行為,糖水偏好降低是動(dòng)物快感缺失的表現(xiàn)——抑郁癥的核心癥狀之一[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,21 d CUMS應(yīng)激結(jié)束后,和正常組相比,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)顯示其他三組大鼠活動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少,靜止時(shí)間增加,水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分降低,糖水偏好率偏低,提示模型制備成功。藥物干預(yù)28 d后,與模型組相比,頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠活動(dòng)總路程增加,水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分均上升,糖水偏好率上升,說(shuō)明頤腦解郁方同鹽酸氟西汀一樣,可改善抑郁大鼠行為,提示頤腦解郁方具有抗抑郁作用。

細(xì)胞因子是一類多肽類物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)功能,尤其是IL-1β和IFN-γ等重要的促炎細(xì)胞因子,可通過(guò)調(diào)節(jié)HPA軸、干擾5-羥色胺(5-hydroxytryptamin,5-HT)的代謝通路、破壞血腦屏障的完整性等多種機(jī)制[20],影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能,參與抑郁的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平高于正常組,提示抑郁癥的發(fā)生與促炎細(xì)胞因子關(guān)系密切。鹽酸氟西汀為治療抑郁癥的一線藥物,可抑制5-HT再攝取,有研究認(rèn)為其還可減少IL-1β、IFN-γ等促炎細(xì)胞因子的分泌和釋放[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平均下降,說(shuō)明頤腦解郁方對(duì)CUMS大鼠血清中促炎細(xì)胞因子的分泌、釋放起到抑制作用。

NLRP3炎性小體是調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的重要分子,它的激活也是導(dǎo)致抑郁癥的重要發(fā)病機(jī)制。NLRP3炎性小體由NLRP3、ASC和Caspase-1三部分組成,其組裝成功后促進(jìn)GSDMD和 IL-1β成熟,其中GSDMD是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白,GSDMD成熟后使細(xì)胞穿孔,釋放細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的IL-1β,促進(jìn)IFN-γ等炎癥因子產(chǎn)生,從而引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)抑郁的發(fā)生[22]。海馬和前額葉皮質(zhì)是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分,參與情緒的調(diào)節(jié),是抑郁癥常累及的部位[23]。研究發(fā)現(xiàn),抑郁小鼠海馬中NLRP3、GSDMD和IL-1β表達(dá)水平明顯升高,而NLRP3基因敲除的小鼠未出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn),GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)水平?jīng)]有升高[4]。本研究結(jié)果顯示,抑郁大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)組織中NLRP3mRNA及NLRP3和GSDMD蛋白表達(dá)水平升高,與其他研究結(jié)果一致。呂霞等[24]的研究發(fā)現(xiàn),氟西汀可抑制CUMS大鼠腦內(nèi)NLRP3炎性小體激活,提示頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組可逆轉(zhuǎn)CUMS應(yīng)激導(dǎo)致的海馬和前額葉皮質(zhì)組織中NLRP3mRNA及NLRP3和GSDMD蛋白表達(dá)的上調(diào),表明頤腦解郁方可抑制NLRP3的激活,減少GSDMD的表達(dá),進(jìn)而減少促炎細(xì)胞因子IL-1β和IFN-γ的成熟和釋放,從而改善CUMS大鼠的抑郁樣行為。

綜上所述,頤腦解郁方可有效改善CUMS大鼠的抑郁樣行為,可能與抑制海馬和前額葉皮質(zhì)組織中NLRP3的激活從而發(fā)揮抗細(xì)胞焦亡和抗炎作用有關(guān)。但是頤腦解郁方為中藥復(fù)方,具有多成分、多靶點(diǎn)和多通路的特性,本實(shí)驗(yàn)僅初步探索其對(duì)NLRP3相關(guān)炎癥蛋白的影響,具體通路和機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。