張道培,劉夢琳,張懷亮

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/河南省眩暈病診療中心/河南省中醫(yī)藥大學(xué)眩暈病研究所,河南 鄭州 450000

后循環(huán)缺血(posterior circulation ischemia,PCI)是缺血性腦血管病的常見類型,約占缺血性腦血管病的20%[1-2]。由于PCI常見臨床癥狀以頭暈/眩暈為主,故多參照中醫(yī)學(xué)“眩暈”病范疇進行辨病辨證[3]。歷代醫(yī)家對于眩暈的病因病機論述頗多,主要有因風(fēng)、因痰、因虛、因火、因瘀5個流派,為后人從不同的角度認(rèn)識和治療眩暈提供了豐富的經(jīng)驗[4]。后循環(huán)血管解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,行程較長且變異多,是中西醫(yī)結(jié)合從瘀論治PCI的病理生理基礎(chǔ)。

通竅活血湯出自王清任的著作《醫(yī)林改錯》,是活血化瘀的名方,全方由赤芍一錢、川芎一錢、桃仁三錢、紅花三錢、老蔥三根、鮮姜三錢、紅棗七個、麝香五厘(絹包)組成,用黃酒半斤煎煮服用,具有活血化瘀、通竅活絡(luò)的功效,現(xiàn)代臨床常用此方治療瘀血阻竅型腦血管病。本課題組在原方的基礎(chǔ)上加全蝎入絡(luò),石菖蒲豁痰,葛根引藥上行組成加味通竅活血湯來治療瘀血阻竅型PCI取得了較好的臨床療效[5],但其作用機制有待進一步闡釋。此項研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討加味通竅活血湯治療瘀血阻竅型PCI的可能機制和潛在靶點,為PCI的中醫(yī)藥研究和治療提供依據(jù)與參考。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分和靶點的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索加味通竅活血湯組方中藥麝香、川芎、赤芍、桃仁、紅花、全蝎、石菖蒲,葛根、老蔥、生姜、大棗的化學(xué)成分,篩選出口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,且類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18的活性成分及其相關(guān)靶點?；赨niprot KB(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫,借助Perl軟件對中藥有效成分對應(yīng)的靶點進行注釋。

1.2 疾病靶點的篩選利用Genecards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)檢索“posterior circulation ischemia”,查找PCI相關(guān)靶點,并進行整合去重。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過VENNY2.1軟件對中藥有效成分相關(guān)靶點和疾病相關(guān)靶點取交集,將獲取的交集靶標(biāo)導(dǎo)入String11.0(https://string-db.org/)中,構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI)。

1.4 篩選核心基因?qū)@得的交集基因?qū)隨tring11.0中,下載PPI網(wǎng)絡(luò)的tsv文件,并導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中,利用CytoHubba插件篩選核心靶點。

1.5 構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)將中藥名稱、藥物有效成分、基因靶標(biāo)等相互之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件進行可視化分析,構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖并分析。

1.6 富集分析將核心靶點基因ID借助R軟件和Bioconductor(http://www.bioconductor.org)數(shù)據(jù)庫的工具包進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析。GO功能富集分析選擇P<0.05的條目進行功能注釋,根據(jù)富集程度均篩選前20個條目繪制成柱狀圖;同樣選擇P<0.05為顯著性通路途徑進行聚類分析,根據(jù)富集程度篩選前20個條目繪制成氣泡圖。

1.7 分子對接從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載核心成分的2D結(jié)構(gòu),通過ChemBio3D 2014軟件將其能量最小化,并把2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)。從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)下載關(guān)鍵靶蛋白3D結(jié)構(gòu)。利用Pymol軟件對靶蛋白受體分子進行去水、去配體小分子等處理,再使用Autodock Tools 4.2.6軟件對靶蛋白受體分子進行加氫等處理,通過Autodock Vina進行分子對接,并用Pymol軟件進行3D展示。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分及靶點通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索加味通竅活血湯組方中藥川芎、赤芍、桃仁、紅花、石菖蒲、葛根、老蔥、生姜、大棗的化學(xué)成分,篩選符合OB≥30%、DL≥0.18的中藥活性成分,其中川芎7個、赤芍29個、桃仁23個、石菖蒲4個、紅花22個、葛根4個、老蔥6個、生姜5個、大棗29個活性成分;通過文獻檢索補充麝香與全蝎的主要成分,其中麝香的主要有效成分麝香酮未能在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到,在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載麝香酮的3D結(jié)構(gòu),利用ParmMapper數(shù)據(jù)庫基于麝香酮的藥效團模型預(yù)測其作用靶點。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取活性成分相關(guān)靶點并借助Uniprot KB數(shù)據(jù)庫和Perl軟件進行注釋后共獲得加味通竅活血湯相關(guān)靶點289個。加味通竅活血湯的部分有效成分信息如表1所示。

表1 加味通竅活血湯部分有效成分信息

2.2 疾病相關(guān)靶點在Genecards數(shù)據(jù)庫檢索“posterior circulation ischemia”查找到PCI相關(guān)靶點1 997個,計算相關(guān)性評分的中位數(shù),保留相關(guān)性評分≥中位數(shù)的疾病靶點;檢索OMIM數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點52個,整合去重后共得到疾病相關(guān)靶點 1 044 個。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)通過VENNY2.1軟件對中藥活性成分靶點和疾病相關(guān)靶點取交集,共獲得了131個交集靶點。將獲取的交集靶點靶標(biāo)導(dǎo)入String11.0(https://string-db.org/)中,選擇“multiple proteins”,物種選擇“homo sapiens”,中等置信度設(shè)為0.40,以構(gòu)建相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

圖1 韋恩圖和PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心基因?qū)?31個交集靶點導(dǎo)入String11.0中預(yù)測PPI網(wǎng)絡(luò)后,剔除1個孤立節(jié)點,下載tsv文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中進行網(wǎng)絡(luò)分析,根據(jù)Degree值篩選出排名前20位的靶標(biāo),見圖2;利用CytoHubba插件,基于MCC算法篩選出10個核心基因,如圖3所示。

圖2 Degree值排名前20位的靶點

圖3 加味通竅活血湯治療PCI的核心靶點

2.5 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)將中藥成分及靶點等相互作用關(guān)系的信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中進行可視化分析,構(gòu)建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,如圖4所示;該網(wǎng)絡(luò)共包括207個節(jié)點(10個中藥名稱節(jié)點、64個化合物成分節(jié)點、131個基因靶標(biāo)節(jié)點、1個方劑名稱節(jié)點、1個疾病名稱節(jié)點)和 669條邊,紅色菱形代表方劑名稱、紫色矩形代表中藥名稱、橢圓形代表有效成分(其中橘色橢圓形代表多種中藥共同含有的成分)、綠色矩形代表基因靶標(biāo)、藍色矩形代表疾病名稱。網(wǎng)絡(luò)分析顯示,度值排名前10位的化合物分別為槲皮素(MOL000098)、17-β-雌二醇(MOL010919)、木犀草苷(MOL000006)、山柰酚(MOL00422)、β-谷甾醇(MOL000358)、黃芩素(MOL002714)、β-胡蘿卜素(MOL002773)、芒柄花黃素(MOL000392)、豆甾烯醇(MOL000449)、楊梅酮(MOL002135),見表2,其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素、β-胡蘿卜素、豆甾烯醇均來自加味通竅活血湯中的多種中藥。

圖4 “中藥-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 度值排名前10位的活性成分

2.6 富集分析通過R軟件及Bioconductor數(shù)據(jù)庫中的clusterProfiler、enrichplot等工具包進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析是對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述的,分為生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組成(cellular component,CC)3個部分,每一類從不同的層面進行基因解釋,顏色越深表示富集越顯著。GO分析結(jié)果顯示,BP主要與對氧氣水平下降的反應(yīng)(response to decreased oxygen levels)、對缺氧的反應(yīng)(response to hypoxia)及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)等生物過程密切相關(guān);MF主要與細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)等相關(guān);CC主要涉及膜微區(qū)(membrane microdomain)、受體復(fù)合體(receptor complex)、囊泡腔(vesicle lumen)及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體(transcription factor complex)等。如圖5所示。

圖5 GO功能富集分析

對獲得的靶標(biāo)進行KEGG通路富集分析,選P值較小、富集程度高的20條通路進行可視化,見圖6氣泡圖。涉及的信號通路主要包括脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路及細(xì)胞凋亡(apoptosis)和癌癥相關(guān)信號通路等。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接通過對“中藥-成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)的分析及文獻查閱,選擇槲皮素、木犀草苷、山柰酚、麝香酮、17-β-雌二醇、β-谷甾醇作為核心成分,分別與核心靶蛋白HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)進行分子對接,見表3。結(jié)合能越低代表受體與配體的親和力越好,選取結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1作為化合物與靶點有效結(jié)合的篩選依據(jù),將每個核心靶蛋白受體分子對接活性最強的化合物通過Pymol軟件進行展示,見圖7。

表3 核心成分與靶蛋白的結(jié)合能 (kJ·mol-1)

3 討論

PCI的主要病因是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),在AS病變過程中始終伴隨著血管重塑(vascular remodeling,VR)[6]。VR的機制可能與血流動力學(xué)刺激、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)改變、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖、凋亡、遷移及炎性反應(yīng)損傷等有關(guān)[7],其中VSMCs的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化以及凋亡是VR的中心環(huán)節(jié)[8]。通竅活血湯是廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療腦血管疾病的中藥經(jīng)典方劑,本課題組通過臨床觀察發(fā)現(xiàn),加味通竅活血湯可明顯改善瘀血阻竅型后循環(huán)缺血患者的臨床癥狀,改善患者的后循環(huán)血流動力學(xué)參數(shù)[7],提示加味通竅活血湯可能影響后循環(huán)的血管重塑,但加味通竅活血湯發(fā)揮臨床療效的確切分子途徑尚不清楚。

本研究檢索出加味通竅活血湯的主要活性成分是槲皮素、17-β-雌二醇、木犀草苷、山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素、β-胡蘿卜素等。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可有效抑制VSMCs增殖,并抑制膠原的合成和分泌,其機制可能與槲皮素可激活磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信號通路,上調(diào)磷酸化PI3K及Akt表達水平,進而抑制NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)運有關(guān)[9];也有研究表明,槲皮素可抑制凝血酶誘導(dǎo)的大鼠VSMCs增殖和遷移,其機制可能與抑制ERK1/2和p38磷酸化有關(guān)[10]。實驗研究發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs鈣化及細(xì)胞炎癥因子分泌[11],還可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈VSMCs分泌MMP-2和MMP-9,這可能是槲皮素參與抗動脈粥樣硬化的途徑之一[12]。研究發(fā)現(xiàn),17-β-雌二醇(17-β-estradiol,17-β-E2)可通過上調(diào)Bax蛋白表達而誘導(dǎo)VSMCs凋亡[13];17-β-E2能下調(diào)血管壁組織的NF-κB和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達,抑制血管壁的炎癥反應(yīng)[14-15];另外,17-β-E2可起到一定的促進血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VECs)自噬的作用[16]。木犀草苷是一種黃酮類化合物,具有抗氧化和清除自由基的能力,可以保護VECs免受鐵過載損傷[17]。山柰酚-3-O-蕓香糖苷能抑制VSMCs的增殖和遷移[18];且山柰酚對炎癥狀態(tài)下的VECs具有顯著的保護作用[19]。β-谷甾醇可通過抑制表皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中炎性小體NLRP3的激活來抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的活化,減少細(xì)胞中 NF-κB、IL-1β的生成,從而達到抗炎作用[20];還可通過影響巨噬細(xì)胞一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生及iNOS等炎癥介質(zhì)的表達進而使VCAM-1的表達下調(diào),阻止 THP-1 單核細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞的黏附起到改善AS的作用[21-22]。麝香酮可通過穩(wěn)定線粒體膜電位,減少Ca2+內(nèi)流,從而抑制過氧化氫誘導(dǎo)的人VECs的凋亡[23];還可通過抑制P-糖蛋白和MMP-9的表達改變體外血腦屏障模型的通透性[24]。黃芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致的VSMCs從收縮表型到合成表型轉(zhuǎn)化[25];還可抑制VSMCs的增殖并促進其凋亡[26]。β-胡蘿卜素對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護作用[27]。綜上,加味通竅活血湯藥效成分可能通過抑制炎癥介質(zhì)的表達保護血管內(nèi)皮,抑制VSMCs的增殖和遷移,從而改善動脈硬化和血管重塑治療PCI。

從核心靶點的角度進行分析,HIF-1是缺氧條件下表達的最重要因子,包括功能亞基α和組成性表達的β亞基,HIF-1α僅在缺氧條件下穩(wěn)定表達,和EGF、血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor,PDGF)等共同協(xié)調(diào)VEGF的表達[28-29];當(dāng)腦血管出現(xiàn)血流動力學(xué)障礙,腦組織缺血缺氧可誘導(dǎo)HIF-1α表達,進而激活VEGFA/VEGFR2信號通路,該信號通路在缺血性腦血管病中參與AS和新生血管生成等病理生理過程。IL-1β 主要是由外周血單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腦小膠質(zhì)細(xì)胞合成,作為促炎細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[30]。MMP-9屬于鋅依賴性蛋白水解酶家族,其來源于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類型,TNF-α和白細(xì)胞介素等炎癥因子可以刺激MMPs的表達;反過來,MMPs降解ECM,促進炎癥細(xì)胞、細(xì)胞表面受體和其他非ECM分子等細(xì)胞的遷移和募集,介導(dǎo)參與細(xì)胞黏附、增殖和凋亡等炎癥過程;MMP-9的升高與多種疾病狀態(tài)有關(guān),如在動脈粥樣硬化斑塊中,基底膜降解導(dǎo)致炎癥細(xì)胞募集和纖維帽破裂,進而導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定和破裂[31-32]。另外,剪切應(yīng)力和動脈壓力等血流動力學(xué)的改變也可以調(diào)節(jié)MMP的表達,參與血管重構(gòu),低流體剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的MMP-9表達與MAPK或ERK1/2/NF-κb信號通路有關(guān)[33]。

本研究KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),靶點主要富集在脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、IL-17信號傳導(dǎo)途徑、TNF信號傳導(dǎo)途徑及細(xì)胞凋亡等信號通路。低流體剪切力可下調(diào)VSMCs的機械敏感性陽離子通道Piezo1而激活I(lǐng)L-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)VSMCs的增殖和遷移[34]。MAPK是一類重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì),能將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核,以應(yīng)對各種不同的刺激(包括細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)等),MAPK信號傳導(dǎo)級聯(lián)包括ERK1/2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶)、JNK(c-jun N末端激酶)和p38(p38蛋白)3種不同的途徑。有研究已證明,MAPK在缺血性腦血管病的各階段均可被激活,表達水平發(fā)生改變,并可能產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[35];ERK1/2的激活常保護神經(jīng)元減少凋亡,p38和JNK的升高可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[36]。MAPK通路和NF-κB的激活與VSMCs中VCAM-1的表達有關(guān)[37],可通過腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的p38和JNK激活刺激VCAM-1的表達[38]。因此本研究推測,VEGFA/VEGFR2信號通路、MAPK信號通路、MMPs信號通路以及VSMCs介導(dǎo)的血管重塑是加味通竅活血湯治療PCI的重要通路。

為了進一步驗證加味通竅活血湯治療PCI的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本研究對加味通竅活血湯的主要成分與核心靶蛋白進行了分子對接。分子對接結(jié)果顯示,槲皮素和木犀草苷與VEGFA、MMP-9、HIF-1α、IL-1β 結(jié)合性較高,山柰酚與VEGFA、MMP-9、HIF-1α的結(jié)合性較高,17-β-雌二醇與VEGFA和MMP-9的結(jié)合能性較高;結(jié)合以上對藥效成分的分析,說明加味通竅活血湯中通過調(diào)節(jié)VEGFA、MMP-9、HIF-1α、IL-1β等靶點發(fā)揮藥效作用的主要成分為槲皮素、木犀草苷、山柰酚和17-β-雌二醇。另外,值得注意的是,作為受體蛋白的 MMP-9 與槲皮素、木犀草苷、山柰酚的結(jié)合性均較高,提示加味通竅活血湯對MMP-9的調(diào)節(jié)可能在瘀血阻竅型PCI的治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,加味通竅活血湯中的槲皮素、17-β-雌二醇、木犀草苷、麝香酮、黃芩素等有效成分可能通過作用于VEGFA、EGF、HIF-1α、MMP-9、IL-1β 等核心靶點調(diào)節(jié)血管壁的炎癥反應(yīng)、VSMCs的增殖、遷移及VECs的損傷和凋亡等,延緩血管重塑,促進血管新生,從而對瘀血阻竅型PCI患者起到改善循環(huán)和神經(jīng)保護的作用。本研究只是從理論上對其進行探討,其結(jié)果有待于進一步基礎(chǔ)實驗驗證。