任周新

河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院/呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州 450046

MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]法是一種檢測細胞增殖和活性的方法,在中草藥活性成分的體外篩選中應(yīng)用廣泛。MTT法的檢測原理為:在細胞培養(yǎng)環(huán)境中加入MTT,活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH) 還原MTT,形成水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚,而死細胞無此功能;加入二甲基亞砜溶解甲瓚,檢測吸光度值,以該值反映樣品活細胞數(shù)量[1-2]。靈敏度高、操作簡單和經(jīng)濟性好的優(yōu)點是這種方法得以廣泛應(yīng)用的原因,但這種方法也有一定的局限,如不能用于某些活性藥物分子的檢測[3-8]。本文就MTT法在中草藥活性成分的應(yīng)用和局限進行概括和總結(jié)。

1 常用的MTT方法

體外培養(yǎng)的細胞,按照是否能貼附于支持物上生長的性質(zhì),分為懸浮型和貼壁型兩大類。這兩類細胞的MTT操作步驟存在差異。

貼壁細胞:向細胞培養(yǎng)液中加入MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)一段時間。然后終止培養(yǎng),加入二甲基亞砜溶液,震蕩溶解甲臜,最后檢測液體的吸光度。需要注意的是,某些測試的中藥化合物分子,本身帶有顏色,需要清除這種干擾?？梢栽诩尤隡TT前,吸棄含藥培養(yǎng)液,用PBS或單純培養(yǎng)液沖洗細胞2～3遍,再加入MTT液。懸浮細胞:在培養(yǎng)液中加入MTT溶液,培養(yǎng)一定時間后,離心,除去上清,加入二甲基亞砜,最后檢測吸光度。WST-8[2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt]是一種水溶性四唑鹽,為MTT的優(yōu)化產(chǎn)品。它的主要特點是在線粒體內(nèi)的脫氫酶反應(yīng)下,還原生成水溶性的甲瓚,因此,可以直接檢測液體的吸光度。盡管WST-8操作更為簡單,但存在不能排除藥物分子顏色干擾的不足。

2 波長的選擇

MTT方法通過檢測甲瓚的吸光度值間接反映細胞的活性或活細胞數(shù)量,檢測波長的確定是關(guān)鍵環(huán)節(jié),文獻報道的檢測波長存在一定波動。在中國知網(wǎng)的高級檢索中,選擇:摘要檢索,輸入MTT;文獻來源,輸入中草藥。查詢《中草藥》雜志1999—2022年發(fā)表的應(yīng)用MTT法評估中藥活性分子影響細胞增殖或活性的研究論文。找到509篇詳細描述MTT方法的論文,選擇490 nm檢測波長的有209篇,選擇570 nm檢測波長的有197篇,選擇492 nm檢測波長的有33篇,選擇540 nm檢測波長的有6篇,選擇550 nm或590 nm檢測波長的各有4篇,選擇595 nm或450 nm的各有3篇,選擇630 nm的有2篇,選擇510 nm、500 nm或493 nm的各有1篇,合計464篇選擇單波長檢測;26篇選擇了檢測波長為570 nm/參比波長630 nm,5篇選擇了檢測波長為570 nm/參比波長620 nm,4篇選擇了檢測波長為570 nm/參比波長450 nm,檢測波長為570 nm/參比波長490 nm、檢測波長為490 nm/參比波長650 nm、檢測波長為595 nm/參比波長630 nm、檢測波長為570 nm/參比波長655 nm各有1篇,6篇未明確檢測波長和參比波長,合計45篇選擇了雙波長檢測。上述報告中,檢測波長范圍為450 nm到630 nm;單波長檢測應(yīng)用較多,達到91.2%,雙波長檢測為8.8%;單波長檢測中,490 nm和570 nm應(yīng)用最多,分別達到45.0%和42.5%。

檢測波長的差異反映了不同的中草藥活性分子或培養(yǎng)液等對MTT法吸收光譜的影響。甲臜的吸收高峰在550～600 nm,這也是較多研究選擇 570 nm 作為檢測波長的依據(jù)。但甲臜的吸收光譜受到多種因素的影響,溶液的酸堿度或某些分子(殘存的培養(yǎng)基分子、細胞殘存的分子以及殘留的藥物分子等)都可能改變甲臜的吸收光譜。應(yīng)預(yù)先采用全波長掃描,在550 nm的一定波長范圍內(nèi),確定最大吸收峰波長,作為檢測波長[9-13]。如果缺乏全波長掃描設(shè)備,則預(yù)先分別采用490 nm或 570 nm 檢測,選擇吸光度值高的波長作為檢測波長。

單波長檢測受到樣本濁度、干擾色和電路(包括噪音、漂移、電壓等)等因素的干擾,因此,設(shè)定另一個參比波長,能夠減少測定干擾和電路干擾,從而減小了結(jié)果的變異系數(shù)CV值,提高結(jié)果的精確度。但多數(shù)情況下,參比波長檢測的光密度OD值較小,不影響對結(jié)果的分析和判斷;另外,雙波長檢測酶標(biāo)儀價格昂貴,普及率不高,這些可能是單波長檢測選擇較多的原因。盡管如此,雙波長檢測更為靈敏和準(zhǔn)確,應(yīng)當(dāng)優(yōu)先選擇應(yīng)用。

3 對照選擇和結(jié)果分析

MTT法經(jīng)常采用的對照有兩種模式:一種是兩孔設(shè)置,樣本孔加入含有藥物的培養(yǎng)液,對照孔加入單純的培養(yǎng)液;另一種是三孔設(shè)置,除了上述兩孔外,還有一個空白孔,該孔沒有細胞,僅加入培養(yǎng)液。

兩種模式的結(jié)果計算如下:兩孔設(shè)置的單波長檢測按照細胞存活率=A藥物/A對照,判斷細胞活力[14-18];三孔設(shè)置的單波長檢測按照細胞存活率=(A藥物-A空白)/(A對照-A空白),判斷細胞活力[19-23]。雙波長檢測按照細胞存活率= (A檢測波長-A參比波長) 實驗組/(A檢測波長-A參比波長) 對照組,判斷細胞活力[24-28]。上述公式中,A指檢測的OD值。

除了應(yīng)用上述公式判斷細胞活力外,還可以用增殖率、抑制率或細胞增殖抑制率等分析藥物的影響[29-33]。如采用細胞增殖抑制率=1-A給藥/A對照[34-38]或抑制率=1-(A給藥-A空白)/(A對照-A空白)[39-41]。還有一些報告,以半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration of 50%,IC50)判斷藥物對細胞增殖的影響[42-48]。

三孔設(shè)計考慮到了培養(yǎng)液對結(jié)果的影響,分析結(jié)果更為準(zhǔn)確,但增加了工作量和培養(yǎng)液的消耗,降低了篩選效率。在實際應(yīng)用中,大量有效成分篩選可選擇兩孔設(shè)計,而準(zhǔn)確性要求高的實驗則可選擇三孔設(shè)計。在結(jié)果的計算分析中,IC50作為判斷藥物對細胞增殖、細胞毒性及細胞活力的指標(biāo),結(jié)果更為嚴(yán)謹和可靠。

4 檢測方法的質(zhì)量控制

需要注意的是,某些化合物可能與MTT直接發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生假陽性結(jié)果,如橙皮苷、木犀草素和槲皮素可直接與MTT反應(yīng),OD值隨著濃度的增加而增加[49-51]。增加藥物培養(yǎng)時間或降低藥物濃度能夠減少假陽性率[52]。另外,在加入MTT前,用培養(yǎng)液或PBS沖洗貼壁細胞,除去殘存藥物,是減少這種干擾的有效方法[11,53]。但有文獻報道紫草素與甲臜的顏色相近,吸收峰部分重疊,在低濃度紫草素的干預(yù)下,MTT法所測得的 A 值會增加。在高濃度紫草素作用下,幾乎沒有活細胞,但仍能檢測到較高的OD值,這種假陽性是進入細胞的紫草素而非甲臜的結(jié)果[54]。顯然,采用加入MTT前清洗細胞的方法無法清除細胞內(nèi)殘存藥物的影響,這就需要用其他方法取代MTT法進行相關(guān)檢測。另外,MTT法應(yīng)用于增殖檢測的基本條件之一,是假設(shè)各實驗組的單個細胞SDH酶活性大致相同。某些藥物通過應(yīng)激、抑制劑非靶效應(yīng)的細胞適應(yīng)性代謝及線粒體重編程可明顯改變細胞SDH活性[55],影響檢驗結(jié)果,甚至得出與事實相反的結(jié)論[5]。這種現(xiàn)象也降低了MTT結(jié)果的可靠性。

為了防止上述現(xiàn)象導(dǎo)致MTT檢測結(jié)果的失真,需要采取一定的質(zhì)量控制方法。例如,應(yīng)用MTT之前觀察細胞,記錄細胞的數(shù)量或密度(定性或定量),與MTT的結(jié)果對照。如果記錄顯示加藥的細胞密度或數(shù)量明顯減少,MTT結(jié)果為增殖,那么否定MTT的結(jié)果。另外,可采用直接細胞計數(shù)、3H-TdR法等方法判斷細胞增殖,采用3H-TdR 法、臺盼藍染色法或5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U)法等判斷細胞活力[49,56-62]。

5 結(jié)語

目前,MTT法已經(jīng)成為評估中草藥活性成分影響細胞增殖、毒性或活性的重要方法。但由于中草藥分子量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,存在某些基團與MTT分子基團相互作用,導(dǎo)致最高吸收峰漂移,此外,某些分子可進入細胞,而這些分子的吸收峰與甲臜相似。這些情況可能造成檢測結(jié)果的失真,甚至產(chǎn)生錯誤的結(jié)論。清洗貼壁細胞等質(zhì)控方法有時不能解決上述問題,因此,聯(lián)合應(yīng)用BrdU、3H-TdR 法、直接細胞計數(shù)或臺盼藍染色法是確保研究結(jié)果可靠的方法。但比色方法BrdU仍然存在化合物分子引起的吸收峰漂移等問題,3H-TdR 法、直接細胞計數(shù)或臺盼藍染色法沒有上述問題,但3H-TdR 法有放射性污染的缺點;直接細胞計數(shù)不能用于細胞活力的評估,對于貼壁細胞,需要引入消化細胞的步驟,會不可避免地破壞某些細胞,也可能導(dǎo)致結(jié)果失真;臺盼藍染色和細胞計數(shù)還存在操作煩瑣、效率低下、靈敏度低等缺點。因此,應(yīng)該根據(jù)檢測的實際情況,選擇上述方法與MTT法聯(lián)合應(yīng)用,綜合分析結(jié)果(圖1),以快速、準(zhǔn)確、客觀地反映藥物干預(yù)效應(yīng)。

圖1 MTT法與其他方法聯(lián)合應(yīng)用評估活性成分干預(yù)細胞的增殖