沈烈行，李群，岳峰梅，張蕊，高洪錄

（1. 山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，山東 濟南 250021； 2. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014； 3. 東營同安胸外科醫(yī)院，山東 東營 257000）

DNA 條形碼技術（DNA barcoding）是近些年發(fā)展起來的分子鑒定的新型技術［1］，它是一段能代表生物遺傳特性的，相對較小的，容易擴增的DNA 片段。近年間，我國應用DNA 條形碼技術對蘚類、芍藥屬、烏頭屬等不同種屬展開科研并效果顯著。目前，對植物科屬的鑒定研究多采用ITS2 序列，并利用GenBank 中的樣本進行了大量的試驗驗證，結(jié)果表明ITS2 序列不僅可以用在植物的鑒定研究上，在動物上也是可行的。DNA 條形碼技術應用于多個領域、多個行業(yè)，針對不同的研究對象和內(nèi)容，尤其在保護生物學、監(jiān)管動植物產(chǎn)品的非法交易、保護食品安全方面表現(xiàn)突出，提供了有效的鑒定方法。

桑白皮為臨床常用中藥，歷代本草多有記載，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列中品，原名“桑根白皮”，其余主流本草基本沿用“桑白皮”名稱。2020 年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，桑白皮來源于?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥根皮。味甘寒，歸肺、脾經(jīng)，具有瀉肺平喘、行水消腫之功效，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚水腫等癥，是中醫(yī)臨床常用的止咳平喘藥，用藥歷史悠久。

山東是我國重要的桑蠶養(yǎng)殖的基地，尤其是在膠東一帶更是如此，據(jù)統(tǒng)計，在煙臺桑園里保存的種質(zhì)資源有300 余份。中藥桑白皮是桑蠶養(yǎng)殖業(yè)的副產(chǎn)品，其獲得途徑主要是廢棄的、生長年限比較長的老桑樹的根皮。在桑蠶養(yǎng)殖業(yè)中，桑樹的新品種是以地上部分，即葉、果等進行區(qū)分，而且往往是在桑樹老樁上通過嫁接手段實現(xiàn)的。因此，作為養(yǎng)殖業(yè)的桑樹新品種，其作為藥用的樹根的根皮（桑白皮）究竟來源于什么品種，是否符合《中華人民共和國藥典》的藥用標準，有待于結(jié)合現(xiàn)代研究手段進行深入研究。

DNA條形碼技術在鑒定植物種屬方面效果顯著［2-12］在其未出現(xiàn)之前對桑白皮的鑒別研究主要是基原、性狀、顯微、理化這四大傳統(tǒng)鑒定方法［13-16］。熊永興等［17］用DNA 條形碼技術對桑白皮及其混偽品進行了鑒定研究，有效區(qū)分了桑白皮及其混偽品。

本研究采用ITS2 片段對采集自山東煙臺桑園的、有代表性的桑樹栽培品種的根皮即桑白皮樣品進行基原鑒定，以確定樣本的基原物種，為進一步的深入研究和桑樹的綜合應用打下基礎。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗藥品

本研究所用桑白皮樣品分別采集自山東牟平栽培場（簡稱牟平）及省桑蠶研究所桑園內(nèi)（簡稱桑園），為桑園培育或栽培的桑樹優(yōu)良及推廣品種，詳見表1。所有樣品采集后立刻放入冰箱冷藏備用。

表1 桑白皮樣品采集信息表

1.2 試劑和儀器

離心機（5810R/5415D，德國Eppendorf公司）；冰箱（BCD－178CN，中國新飛）；上部卸料離心機（SSC 型，中國捷達）；PCR 儀（96 普通型，中國領宇科技）；測序儀（3730，美國ABI 公司）；電子天平（BSM120.4，上海卓精電子科技有限公司）；球磨儀（MM400，德國萊馳）；電泳儀（JY1000C，北京君意）；水浴鍋（HH－4Y，中國啟前）。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，天根生化科技北京有限公司，批號：DP305）；Platinum?Taq DNA Polymerase［Thermo Fisher、10 × PCR Buffer，Mg2+（50 mmol/L）］；10 μM dNTP Solution（Thermo Fisher）；CTAB提取液（2% CTAB，100 mmol/L pH8.0 Tris－HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA）；液氮；TE緩沖液（10 mmol/L Tris－Hcl，1 mmol/L EDTA pH值8）。

β－巰基乙醇（今品化學技術上海有限公司），氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇（天津市富宇精細化工有限公司），均為分析純。

1.3 提取DNA

取各樣品新鮮根皮組織約30 mg，加入液氮充分研磨。使用植物基因組DNA 試劑盒按照說明書提取DNA。

1.4 聚合酶鏈式反應（PCR）擴增和測序

采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR 產(chǎn)物，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后再進行雙向測序。

聚合酶鏈式反應（PCR）擴增物由上海生工生物有限公司（合成）。ITS2F：5'－ATGC GATA CTTG GTGT GAAT－3' ；ITS3R：5' －GACG CTTC TCCA GACT ACAAT－3'。PCR 反應體系中各組分、 PCR 反應條件分別見表2和表3。

表2 PCR體系中各組分的體積

表3 PCR反應條件

1.5 數(shù)據(jù)分析

序列拼接時應用CodonCode Aligner 2.06（CondonCode Co，USA）軟件進行序列拼接及校對。首先進行測序質(zhì)量評估及預處理，即去除測序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對剩余部分進行質(zhì)量評估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接，對于ITS2 序列，根據(jù)Hidden Markov Model（HMM）模型，去除序列兩端5.8 s和28 s 基因區(qū)，獲得完整的ITS2 基因間隔區(qū)序列［18］。然后根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST 鑒定以及進行DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 DNA定量結(jié)果

檢測結(jié)果顯示10個樣本DNA含量合格，符合測序要求，結(jié)果見表4和圖1。

圖1 DNA條帶結(jié)果

表4 DNA定量檢測結(jié)果

2.2 對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測結(jié)果

電泳檢測DNA完整性及DNA殘留情況結(jié)果顯示，10個樣本的DNA完整性較好，可以進行PCR擴增和測序。見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 測序結(jié)果

樣品PCR 擴增測序后，去除序列兩端5.8 s 和28 s基因區(qū)，獲得基因間隔區(qū)序列，幾個基因的間隔區(qū)序列完全一致。

2.4 BLAST鑒定結(jié)果

2.4.1 DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定

經(jīng)DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定，結(jié)果顯示10個樣本與表內(nèi)物種序列相似度100%，可鑒定為桑屬。結(jié)果見表5。

表5 序列對比信息表

2.4.2 GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST鑒定

結(jié)合 GenBank 數(shù)據(jù)庫BLAST 鑒定結(jié)果，所采集的桑白皮樣品皆為桑屬（Morus）。見圖3。

圖3 BLAST鑒定圖

3 討論

桑白皮原植物桑樹資源十分豐富，目前市場藥材來源桑種包含《中華人民共和國藥典》規(guī)定的桑（Morus albaL.）等在內(nèi)的多種來源，既有野生，也有家種。由于采收時須毀樹挖根，因此古代桑白皮主要來源于野生桑樹的可能性較大。歷史上桑類中藥的原植物確為多種桑樹，桑類中藥的不少藥材來源于養(yǎng)蠶業(yè)的剩余物，因而桑類中藥的原植物來源于某一種桑樹的可能性很小。當今中國桑樹資源源于不同桑種的桑樹栽培品種上千余個，僅山東煙臺保存的種質(zhì)資源就超過300 份，而各地推廣的品種多是為桑蠶業(yè)改良，亦因追求產(chǎn)葉量而經(jīng)常改變。同時，由于桑樹易于自然雜交，人工雜交的品種亦層出不窮，雖然歷版《中華人民共和國藥典》中，桑類中藥的原植物Morus albaL.，但是一方面尋找純粹的Morus albaL. 已非易事，另一方面，如果將非Morus albaL. 的桑樹排除在桑類中藥原植物之外的話，也無助于改變長期以來養(yǎng)蠶后桑樹資源嚴重浪費的現(xiàn)狀，不利于資源的有效利用。

中藥桑白皮具有明確的藥用療效和使用價值，在臨床上應用也十分廣泛。本次實驗對山東產(chǎn)或栽培的不同批次的792、湖桑、農(nóng)桑、雞冠魯桑等進行基原鑒別研究，通過DNA 條形碼技術對ITS2基因間隔區(qū)序列進行一一比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有目標樣品都為桑屬，為進一步研究和不同品種桑樹的綜合應用打下基礎。

本文再次證明ITS2 序列鑒定相比傳統(tǒng)鑒別方法更優(yōu)，效果更明顯，是一種有效、精確的鑒定方法。但是此技術并不是十全十美，依舊存在著諸多缺陷和挑戰(zhàn)，更不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)鑒定方法。不同的藥材具有不同的入藥部位，若由于環(huán)境、操作、貯存等諸多因素導致DNA 降解過多，必然會影響鑒定的準確性。倘若在實際操作中需要鑒定某一中藥材，除用此技術外，還需輔以其他方法進行藥材的綜合鑒定，以確保鑒定結(jié)果的科學性和準確性。