趙靈靈，周政，賈文瑞，王娟

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見(jiàn)的全身性自身免疫性炎癥疾病，其臨床特點(diǎn)主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，可嚴(yán)重?fù)p害患者身體功能和生活質(zhì)量［1］。一項(xiàng)對(duì)41個(gè)國(guó)家的67項(xiàng)RA隊(duì)列發(fā)病率和患病率研究的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，1986—2014 年全球RA 的患病率為0.46%（95%CI，0.37%～0.57%））［2］。有報(bào)道顯示，目前我國(guó)RA 患病率為0.42%，總患病人數(shù)已達(dá)500 萬(wàn)［3］。大量的臨床研究表明，與普通人群相比，RA 患者發(fā)生嚴(yán)重感染、呼吸道疾病、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、癌癥和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高［1，4-5］。因此，尋找安全、有效的治療RA藥物具有重要的意義。

金藤清痹顆粒具有清熱解毒、活血消腫、通痹止痛之功，臨床主要用于RA 活動(dòng)期［6］。目前，有關(guān)金藤清痹顆粒治療RA 的基礎(chǔ)研究報(bào)道較少，多為臨床療效觀察［7-8］。代謝組學(xué)技術(shù)因其具有整體性、動(dòng)態(tài)性、高靈敏度和高通量等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，利用現(xiàn)代分析技術(shù)定量測(cè)定生物體液內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，如脂質(zhì)、氨基酸和有機(jī)物的變化，結(jié)合生物信息學(xué)闡明內(nèi)源性小分子代謝物變化規(guī)律，為揭示中藥發(fā)揮藥效的“多途徑-多靶點(diǎn)”作用機(jī)制提供了可能［9-10］。因此，本研究基于代謝組學(xué)開(kāi)展金藤清痹顆粒治療RA的作用機(jī)制，為金藤清痹顆粒向臨床進(jìn)一步深入推廣提供參考和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD雄性大鼠30只，來(lái)源于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2020－0004），6 周齡，清潔級(jí)，體質(zhì)量（170 ± 10）g，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件為溫度（25 ± 2）℃，相對(duì)濕度（45 ± 5）%，12 h 光照條件下飼養(yǎng)7 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)取得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生命科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：K2020－0005。

1.2 藥品

雙氯芬酸鈉（中國(guó)希恩思生化科技有限公司，批號(hào)：201007）；金藤清痹顆粒（魯南厚普制藥有限公司，批號(hào)：28210041）。

1.3 主要試劑與儀器

C 反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)分別為2010－2、2008－2、Z18037186）；牛Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）、弗氏不完全佐劑（IFA）、弗氏完全佐劑（CFA）（Sigma 公司，批號(hào)分別為20200235、SLBR0324A、SLBR3879V）；乙腈（Merck 公司，批號(hào)：1499230－935）；乙酸銨（Sigma公司，批號(hào)：70221）。

色譜柱：Waters， ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm）；BX53 型電子顯微鏡、DP72CCD 相機(jī)（日本Olympus）；Sunrise 酶標(biāo)儀（瑞士Teacan 公司）；TGL－16M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；DW－HL508 型超低溫冰箱（安徽中科美菱低溫科技股份有限公司）；Leica UC7 型超薄切片機(jī)（Leica）；AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀（AB SCIEX）；Agilent 1290 Infinity LC 超高壓液相色譜儀（Agilent）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，依據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組（Control 組）、模型組（Model 組）、雙氯芬酸鈉陽(yáng)性藥組［SLFSN 組，3 mg/（kg·d）］、金藤清痹顆粒高劑量組［JTQB－H 組，6.30 g/（kg·d）］和金藤清痹顆粒低劑量組［JTQB－L 組，3.15 g/（kg·d）］，每組6 只。Control組和Model 組大鼠灌胃給予生理鹽水，其余組給予相應(yīng)藥物，給藥周期為28 d。除對(duì)照組外，其余各組大鼠參考文獻(xiàn)［11］采用膠原誘導(dǎo)RA 大鼠模型，實(shí)驗(yàn)第1天，多點(diǎn)給予CⅡ 5 mg/mL 與含結(jié)核分枝桿菌CFA的混合乳劑注射大鼠尾部和左后足進(jìn)行初次免疫；實(shí)驗(yàn)第21 天，在大鼠尾根部相同部位多點(diǎn)給予CⅡ與IFA 的混合乳劑加強(qiáng)免疫。對(duì)照組在相同實(shí)驗(yàn)周期給予生理鹽水注射。

2.2 取材

末次給藥后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，部分全血置于涂有肝素鈉的EP 管中，其余全血放于普通試管中，3 000 r/min 離心10 min 分離血漿和血清，其中血漿用于代謝組學(xué)研究，血清用于檢測(cè)TNF－α、IL－1β、RF 水平。處死大鼠后，采用線環(huán)繞踝關(guān)節(jié)方法測(cè)量關(guān)節(jié)的腫脹度，取部分踝關(guān)節(jié)組織，置于4%多聚甲醛固定用于病理學(xué)觀察。

2.3 代謝組學(xué)分析

2.3.1 血漿處理

將各組血漿于4 ℃環(huán)境解凍后，取適量樣本加入預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，14 000 ×g4 ℃離心20 min，取上清真空干燥，分析時(shí)加入100 μL乙腈水溶液（乙腈∶水 = 1∶1，V/V）復(fù)溶，渦旋，14 000 ×g4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3.2 色譜條件

Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統(tǒng)（UPLC），HILIC 色譜柱進(jìn)行分離；柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相組成為A：水+25 mmol/L乙酸銨+ 25 mmol/L氨水，B：乙腈。梯度洗脫條件：0→0.5 min，95% B；0.5 min→7 min，95%→65% B；7 min→8 min，65%→40% B；8 min→9 min，40% B；9 min→9.1 min，40%→95% B；9.1 min→12 min，95% B。

2.3.3 質(zhì)譜條件

采用AB Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀進(jìn)行樣本一級(jí)、二級(jí)譜圖的采集。ESI 源條件：Ion Source Gas1：60，Ion Source Gas2：60，Curtain gas：30，IonSapary Voltage Floating：± 5 500 V（正負(fù)兩種模式）；TOF MS scan m/z range：60～1 000 Da，product ion scan m/z range：25～1 000 Da；二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition獲取，并且采用high sensitivity 模式，Declustering potential： ± 60 V（正負(fù)兩種模式），Collision Energy：（35 ±15）eV。

2.3.4 數(shù)據(jù)分析

將質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入R 軟件，進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS－DA）。OPLS－DA 模型的變量重要性投影（VIP）初步篩選出各組代謝物，選取VIP > 1.0 且P< 0.05 的變量進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

2.3.5 質(zhì)控

質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積制備而成，每個(gè)QC 的體積與待測(cè)樣本分析方法一致，以考察整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的穩(wěn)定性。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0（IBM， Armonk，USA）統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果用±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的比較

與Control 組比較，Model 組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著升高（P< 0.01），踝關(guān)節(jié)部位紅腫較嚴(yán)重。與Model組比較，SLFSN、JTQB－H、JTQB－L 組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低（P< 0.05），踝關(guān)節(jié)部位紅腫明顯減輕。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度情況比較

3.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理情況比較

Control 組大鼠踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常完整，Model組大鼠踝關(guān)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)明顯的病變和損傷，其中滑膜細(xì)胞增生顯著，并伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。SLFSN、JTQB－H 和JTQB－L 組踝關(guān)節(jié)病變和損傷均得到一定改善，其中滑膜細(xì)胞出現(xiàn)輕度增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色圖（×200）

3.3 各組大鼠血清TNF－α、IL－1β和RF水平比較

與Control組比較，Model組血清IL－1β水平顯著升高（P< 0.01），與Model 組比較，SLFSN、JTQB-H 和JTQB－L組血清IL－1β顯著降低（P< 0.01，P< 0.05）；與Control 組比較，Model 組血清TNF－α 顯著升高（P<0.01），與Model 組比較，SLFSN、JTQB－H 組血清IL－1β 顯著降低（P< 0.01，P< 0.05）；與Control 組比較，Model組血清RF顯著升高（P< 0.01），與Model組比較，SLFSN組血清RF顯著降低（P< 0.05），其余各組均無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清TNF－α、IL－1β和RF水平變化（± s，pg/mL）

表1 各組大鼠血清TNF－α、IL－1β和RF水平變化（± s，pg/mL）

注：與Control 組比較，**P < 0.01；與Model 組比較，△P < 0.05，△△P < 0.01。

組別Control組Model組SLFSN組JTQB－H組JTQB－L組n6 6 6 6 6 TNF－α 123.39 ± 56.29 301.90 ± 53.85**194.88 ± 43.98△△196.54 ± 63.11△220.50 ± 86.99 IL－1β 154.21 ± 23.46 226.56 ± 34.66**156.90 ± 35.64△△167.88 ± 31.35△171.56 ± 45.81△RF 106.73 ± 20.15 179.96 ± 48.98**116.89 ± 13.96△157.71 ± 32.16 172.75 ± 10.78

3.4 各組RA大鼠血漿代謝組學(xué)情況比較

病理學(xué)觀察和藥效學(xué)顯示，JTQB－H 組改善RA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度和炎癥狀態(tài)、抗炎藥效指標(biāo)顯示出更好的優(yōu)勢(shì)，因此本研究選擇JTQB－H 組大鼠開(kāi)展代謝組學(xué)相關(guān)研究。

3.4.1 QC樣本總離子流圖比較

將QC 樣本總離子流圖進(jìn)行譜圖重疊比較，結(jié)果各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，說(shuō)明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器誤差引起的變異較小。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同離子模式 QC 樣本總離子流圖重疊譜圖

3.4.2 各組樣本代謝輪廓分析

對(duì)所得數(shù)據(jù)使用PCA 分析，結(jié)果表明Control 組與Model 組明顯分離，說(shuō)明CIA 造模成功，給予金藤清痹顆粒后，JTQB－H 組與Model 組分離明顯，且有向Control 組回調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明金藤清痹顆粒對(duì)RA 模型具有較好的治療作用。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.4.3 差異代謝物篩選

基于OPLS－DA進(jìn)一步對(duì)正、負(fù)離子模式下Model組和JTQB－H 組所檢測(cè)到的所有代謝物進(jìn)行差異分析，并繪制正、負(fù)離子代謝物火山圖。以VIP > 1、P<0.05 作為篩選差異代謝物條件，并結(jié)合HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)，最終篩選出12 個(gè)差異代謝物，其中負(fù)離子模式下篩選出4 個(gè)差異代謝物，正離子模式下篩選出8個(gè)差異代謝物。結(jié)果見(jiàn)圖5和表2。

表2 正、負(fù)離子模式顯著性差異代謝物

圖5 不同離子模式下Model組和JTQB-H組代謝物火山圖

3.4.4 差異代謝物的相關(guān)通路分析

對(duì)上述差異代謝物通過(guò)KEGG 進(jìn)行生物途徑富集分析，篩選潛在的關(guān)鍵代謝通路，結(jié)果提示金藤清痹顆粒主要通過(guò)調(diào)節(jié)甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝等通路發(fā)揮治療RA 的作用。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG富集通路圖

4 討論

研究顯示，RA的早期診斷和治療可以避免或減緩90%的患者關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)展，從而防止不可逆的殘疾［12］。目前，臨床中常用治療RA 的藥物有抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等［13-15］，上述藥物可有效減輕RA患者疼痛和腫脹，并改善身體功能和抑制關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)性損傷進(jìn)展。但部分藥物會(huì)出現(xiàn)一系列的不良反應(yīng)，嚴(yán)重限制了其在臨床中的使用，如抗風(fēng)濕藥甲氨蝶呤在使用過(guò)程中易引起肝、腎毒性、加重感染及胃腸道不適等不良反應(yīng)［16］；糖皮質(zhì)激素藥潑尼松龍長(zhǎng)期使用易引起多系統(tǒng)代謝紊亂，如骨質(zhì)疏松癥和胃潰瘍等［17］；生物制劑如腫瘤壞死因子抑制劑會(huì)增加老年患者首次住院和心力衰竭加重的風(fēng)險(xiǎn)［18］。因此，對(duì)RA 治療藥物的安全性、有效性提出了更高的要求。

金藤清痹顆粒由金銀花、青風(fēng)藤、白芍、生地黃、白花蛇舌草、當(dāng)歸、鹿銜草、玄參、蜈蚣和甘草組成，源于清代鮑相璈所編《驗(yàn)方新編》中的四妙勇安湯［8］。有研究顯示，青風(fēng)藤中總生物堿可通過(guò)降低RA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹，血清中的P－選擇素和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)，從而緩解RA 癥狀［19］。白芍中的白芍總苷可通過(guò)降低類(lèi)風(fēng)濕因子、C 反應(yīng)蛋白、調(diào)節(jié)糞球菌屬Coprococcus 的相對(duì)豐度誘導(dǎo)自身免疫耐受和減輕炎癥反應(yīng)治療RA［20］。白花蛇舌草中的阿魏酸通過(guò)抑制血栓素的分泌，下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及軟骨細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶－3 的表達(dá)，進(jìn)而改善軟骨基質(zhì)治療RA［21］。鹿銜草可減少炎癥早期的滲出，抑制組織增生和肉芽形成，且能增加胸腺和脾臟重量，提高免疫功能［22］。蜈蚣可明顯減輕治療大鼠炎癥和關(guān)節(jié)損傷，調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群平衡，下調(diào)TNF－α 和IL－1β、上調(diào)IL－4 和IL－10 水平，顯著抑制抗Ⅱ型膠原抗體水平［23］。綜上可知，金藤清痹顆?？赡芡ㄟ^(guò)多組分、多途徑發(fā)揮治療RA的作用。

本研究對(duì)金藤清痹顆粒治療RA 進(jìn)行了初步的藥效學(xué)考察，結(jié)果顯示給藥4 周后，與Model 組相比，JTQB－H 組可顯著降低大鼠血清TNF－α、IL－1β 水平（P< 0.05），JTQB－L 組可顯著降低大鼠血清IL－1β 水平（P< 0.05），且呈一定的量效關(guān)系，此外JTQB－H、JTQB－L 組均能有效降低CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹及減少滑膜細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明RA具有較好的治療RA 作用。唐今揚(yáng)等［24］研究發(fā)現(xiàn)，金藤清痹顆粒可減輕RA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹，顯著降低外周血中IL－1β、IL－17水平（P< 0.05），與本研究結(jié)果一致。金藤清痹顆?？赏ㄟ^(guò)調(diào)控TLR4/NF－κB 信號(hào)通路來(lái)改善免疫微環(huán)境，從而緩解RA相關(guān)癥狀［25］。

為進(jìn)一步深入探討金藤清痹顆粒治療RA 的作用機(jī)制，本研究采用代謝組學(xué)觀察JTQB－H 對(duì)RA 大鼠體內(nèi)代謝物的影響。結(jié)果顯示，JTQB－H 可上調(diào)11－酮－β－乳香酸，下調(diào)DL－絲氨酸、苯乙酸、苯乙酰甘氨酸等在內(nèi)的12 個(gè)顯著差異代謝物。有研究發(fā)現(xiàn)，11－酮－β－乳香酸的納米顆粒配方不僅可增加其1.7 倍抗炎活性，更能提高其7 倍的口服利用度［26］。ZHANG 等［27］在探討中藥復(fù)方黃連解毒湯及其成分對(duì)RA 大鼠作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可使RA 模型組大鼠苯乙酰甘氨酸水平恢復(fù)正常。苯乙酸致炎狀態(tài)可能與其增加多形核白細(xì)胞各種功能的激活和表面CD11b 和CD18 的表達(dá)有關(guān)［28］。以上報(bào)道結(jié)合本次篩選的差異代謝產(chǎn)物結(jié)果，提示金藤清痹顆粒發(fā)揮治療RA 藥效可能是通過(guò)調(diào)控多個(gè)代謝物共同發(fā)揮作用。

對(duì)上述差異代謝物進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)金藤清痹顆粒主要通過(guò)調(diào)控甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝、氨酰tRNA 生物合成等通路來(lái)發(fā)揮療效。石愛(ài)華等［29］利用代謝組學(xué)探討清熱養(yǎng)陰湯治療RA 的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控通路涉及氨酰tRNA 生物合成、絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝等通路。趙傳怡［30］在探討牛白藤中龍膽苦苷治療RA及其代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控的通路主要與苯丙氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨酰生物合成等代謝通路相關(guān)?？梢?jiàn)，甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝、氨酰tRNA 生物合成與RA 密切相關(guān)，金藤清痹顆?？赏ㄟ^(guò)調(diào)控上述氨基酸代謝通路發(fā)揮治療RA療效。