陳喜宏,路桂聰,王浩磊,茍少校,玉永雄,林 濤,2*,蔣曹德*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 重慶市食草動(dòng)物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心,重慶 400715;2.廣安市飼料工業(yè)管理站,廣安 638000)

奶牛乳腺炎又稱乳房炎(mastitis),是奶牛養(yǎng)殖過程中一種常見且危害嚴(yán)重的炎性疾病。奶牛乳房炎會(huì)減少奶牛泌乳量、降低乳產(chǎn)品質(zhì)量、增加奶牛淘汰率,造成養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)損失上升[1]。奶牛乳房炎主要分為隱性和臨床乳房炎。奶牛乳房炎主要由病原微生物引起,主要的病原菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等。此外,布氏桿菌可能造成全身性感染而導(dǎo)致奶牛乳房病變[2]。研究發(fā)現(xiàn),由大腸桿菌引起的奶牛乳房炎會(huì)從血液中調(diào)動(dòng)白細(xì)胞進(jìn)入乳腺,使臨床型的乳腺炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[3]。

目前國內(nèi)外對(duì)于奶牛乳房炎的治療主要采用抗生素療法?？股卦谌榉垦装l(fā)生初期可以有效殺死病原菌,特別是急性臨床型乳房炎。但是,抗生素的大量使用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生副作用,如機(jī)體免疫機(jī)能下降、胃腸道菌群紊亂等[4]。此外,抗生素會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性,奶牛乳汁也會(huì)殘留抗生素危害人類健康。植物提取物具有安全性高、無藥物殘留和無耐藥性等優(yōu)點(diǎn),可以改善動(dòng)物機(jī)體的免疫力,因此被廣泛應(yīng)用于畜禽飼料添加劑[5]。因此,研究植物提取物的抗炎作用,對(duì)于篩選奶牛乳房炎的抗生素替代防治方法具有重要的理論和實(shí)踐意義[6]。

研究發(fā)現(xiàn),異綠原酸(isochlorogenic acid, ICA)具有抗氧化、心血管保護(hù)、抗菌、抗病毒、降糖、保護(hù)肝、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[7]。ICA最初于1950年從咖啡提取物中分離出來,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)于茶、蔬菜和中藥材等多種天然植物中[7]。ICA是一種由一分子奎寧酸和兩分子咖啡酸組成的多酚類物質(zhì)——雙咖啡酰奎寧酸,有異綠原酸A、B和C(ICAA、ICAB、ICAC)三種異構(gòu)體[7]。茶葉、西紅柿和甘薯的相關(guān)研究揭示了ICAA為抗氧化劑和醛糖還原酶抑制劑[8-10]。Wang等[9]報(bào)道ICA抑制了LPS(lipopolysaccharide)誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NO的水平;體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí),異綠原酸A對(duì)膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型有較好的抗炎作用,劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、白介素6 (IL-6)、IL-1β水平[11-12];其他研究進(jìn)一步證實(shí)了ICAA通過NF-κB (nuclear factor kappa B)/NLRP3 (NLR family pyrin domain containing 3)通路抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎[13-14]。迄今為止發(fā)表的文獻(xiàn)集中在ICAA藥代動(dòng)力學(xué)研究以及在小鼠模型中ICAA、ICAB抗氧化和抗炎作用,但是ICAC的相關(guān)功能以及ICA對(duì)牛奶乳腺炎抑制作用很少有研究報(bào)道。

NF-κB是經(jīng)典的炎性反應(yīng)通路[15],NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中的重要作用已在小鼠乳腺上皮細(xì)胞[16-19]、RAW264.7細(xì)胞[20-21]、BV-2細(xì)胞[22]中得到廣泛證實(shí)。因此,本研究選擇牛乳腺上皮細(xì)胞MAC-T,采用LPS誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞建立炎癥模型,分析ICAC對(duì)炎癥因子和NF-κB通路關(guān)鍵成員的表達(dá)及其活性的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),將MAC-T細(xì)胞(BMCC,CHN)培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱(Forma Series 3 WJ, Thermo, USA)。細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液,加入10% FBS(Gibco, AUS)、1%青鏈霉素(Solarbio, CHN)和100 mg·L-1的鏈霉素(Solarbio, CHN)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長到90%時(shí)用0.25%胰酶(Solarbio, CHN)消化并傳代。

1.2 細(xì)胞活性檢測

MAC-T細(xì)胞按照2×106個(gè)·孔-1的濃度接種在6孔板中,待其貼壁后添加不同濃度的ICAC(0、20、40、60、80、100、120、160 mg·L-1),并設(shè)置5個(gè)重復(fù)。處理細(xì)胞24 h后,吸棄上清,加入10 μL MTT(Solarbio, CHN)和90 μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)液,再加入110 μL Formazan(Solarbio,CHN)共育10 min,光密度計(jì)(Multiskan GO, Thermo, USA)檢測490 nm處的光密度(OD),并計(jì)算處理組相對(duì)對(duì)照組的細(xì)胞活性。細(xì)胞活性 =(處理組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn)

選取50只(30只雌鼠和20只公鼠)6～8周齡的BALB/c小鼠(伯恩斯韋爾生物技術(shù)有限公司,重慶),母鼠每籠2只,公鼠每籠1只,并在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)1周,自由采食(光照/黑暗各12 h)。1周后,2只母鼠和1只公鼠合1籠進(jìn)行交配。1周后將公鼠分出,母鼠單籠飼養(yǎng)。母鼠分娩7 d后,將哺乳期母鼠隨機(jī)分成6組,每組5只,各組分別為空白對(duì)照組、LPS組、LPS+DEX(dexamethasone)(Macklin,CHN)[23]、LPS+ICAC(60 mg·kg-1)、LPS+ICAC(80 mg·kg-1)、LPS+ICAC(100 mg·kg-1)組[16]。LPS(200 mg·L-1,50 μL)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中,用2 mL注射器(6號(hào)針頭)注射到每只哺乳期母鼠最容易觀察和采集的第四對(duì)乳頭(R4和L4)的乳腺導(dǎo)管中[24]。ICAC處理組的每只哺乳期母鼠用9 μL 4%水合氯醛深度麻醉,在LPS滴注前1 h腹腔注射不同濃度ICAC(60、80、100 mg·kg-1),空白對(duì)照組和LPS組腹腔注射等體積的PBS,DEX組注射0.5 mg·kg-1的DEX[24]。注射LPS 24 h后,通過頸椎脫臼處死小鼠,收集乳腺組織,一部分儲(chǔ)存在-80 ℃,另一部分存放于4%多聚甲醛組織固定液里。

1.4 炎癥因子表達(dá)水平檢測

MAC-T細(xì)胞按照2×106個(gè)·孔-1接種于6孔板中待其貼壁,隨后培養(yǎng)在含有不同濃度ICAC(0、20、50、80 mg·L-1)和1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)液中,并設(shè)置未處理和20 mg·L-1的DEX處理對(duì)照[24]。24 h后收集細(xì)胞上清液,按照IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS ELISA試劑盒說明書(重慶博諾恒生物科技有限公司)測定各炎性因子的濃度。

1.5 Western blot分析

上述“1.4”培養(yǎng)的細(xì)胞采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒(Solarbio,CHN)提取總蛋白,隨后用BCA蛋白定量試劑盒(Vazyme,CHN)進(jìn)行總蛋白定量。取16 μL蛋白樣品,加入4 μL上樣緩沖液(Solarbio,CHN)后煮沸5 min使蛋白變性,采用10% SDS-PAGE電泳(PowerPac HC,Bio-rad,USA)。電泳條帶通過轉(zhuǎn)印設(shè)備(1703812,Bio-rad,USA)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Biosharp,CHN),在含有5%牛血清白蛋白(Biotopped,CHN)的封閉液中室溫封閉1 h(磷酸化蛋白封閉4 h),進(jìn)一步與一抗4 ℃孵育過夜,其中一抗包括β-actin(bsm-33036M;稀釋比1∶10 000)、p65(bs-23217R,稀釋比1∶1 000)、磷酸化p65(p-p65)(bs-0982R,稀釋比1∶1 000)、IκBα(bs-1287R,稀釋比1∶1 000)、磷酸化IκB(p-IκB)(bs-2513R,稀釋比1∶1 000)。將上述一抗雜交膜使用TBST洗滌(6 min,5次),隨后與二抗Goat Anti-rabbit IgG/HRP(AB501-01A,Novoprotein,CHN)室溫孵育1 h。孵育結(jié)束后,使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Gel Doc XR,Bio-Rad,USA)檢測目標(biāo)條帶,并使用Image Lab(version 5.2.1, Bio-Rad, USA)和GraphPad Prism(version 8.2)進(jìn)行定量分析。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),以20 mg·L-1DEX和1 mg·L-1LPS共處理作為陽性對(duì)照。

1.6 p65核轉(zhuǎn)移免疫熒光檢測

MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板至90%融合,將細(xì)胞分為6組:空白對(duì)照組、LPS組、LPS+DEX組、LPS+ICAC(20、50、80 mg·L-1),按照Beyotime試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 乳腺組織免疫組織化學(xué)試驗(yàn)

將處理好的乳腺組織在甲醇中脫水,隨后使用石蠟包埋,制作成5 μm石蠟切片,將CD3抗體(Abcam,稀釋比1∶150)與石蠟切片一起放入4 ℃孵育過夜。用PBS洗滌3次,在室溫下與Goat Anti-rabbit IgG/HRP(AB501-01A,Novoprotein,CHN)在室溫下孵育1 h,通過DAB染色將信號(hào)可視化,蘇木精進(jìn)行細(xì)胞核染后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),多重比較采用Duncan’s法,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ICAC對(duì)MAC-T細(xì)胞活性的影響

采用不同濃度ICAC處理MAC-T細(xì)胞,檢測ICAC對(duì)MAC-T細(xì)胞活性的影響(圖1)。與對(duì)照組相比,濃度為20、40、60、80和100 mg·L-1的ICAC對(duì)MAC-T細(xì)胞活性均沒有顯著影響(P>0.05)。當(dāng)ICAC濃度大于120 mg·L-1時(shí),與對(duì)照組相比,MAC-T細(xì)胞的活性顯著降低(P<0.05)。因此,選用20、50、80 mg·L-1的ICAC處理MAC-T細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

柱形圖上相同小寫字母表示P>0.05,不同小寫字母表示P<0.05(下同)The same lowercase letters above the bars indicate P>0.05, and different lowercase letters mean P<0.05 (the same below)圖1 不同濃度的ICAC處理對(duì)MAC-T細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of ICAC treatment with different concentrations on the activity of MAC-T cells

2.2 ICAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAC-T炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激的抑制

采用不同濃度的ICAC和 LPS共處理MAC-T細(xì)胞,檢測ICAC對(duì)炎性與氧化應(yīng)激因子的表達(dá)(圖2)。與空白對(duì)照組相比,LPS處理組炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白質(zhì)水平極顯著增加(P<0.01),氧化應(yīng)激因子COX-2和iNOS的表達(dá)量也極顯著上調(diào)(P<0.01)。與LPS處理組相比,20、50、80 mg·L-1ICAC處理組IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01)。

與空白對(duì)照相比,柱形圖上##表示P<0.01;與LPS處理組相比,*和**分別表示P<0.05和P<0.01,下同Compared with the blank control, ## on the bar chart represents P<0.01; compared with LPS treatment group, * and ** represent P<0.05 and P<0.01, respectively, the same as below圖2 ICAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá)的影響Fig.2 Effect of ICAC on LPS-induced expression of inflammatory factors

2.3 ICAC對(duì)MAC-T細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的抑制

利用Western blot檢測ICAC對(duì)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白(p65和IκB)磷酸化水平的影響(圖3)。與空白對(duì)照組相比,LPS處理后p65和IκB的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05,圖3A～C),但是p-p65和p-IκB水平顯著上升(P<0.05)(圖3D)。相反,20、50和80 mg·L-1ICAC處理顯著降低了LPS誘導(dǎo)的p-p65和p-IκB水平(P<0.05),且ICAC處理組p-p65水平顯著低于DEX處理組(P<0.05)。

進(jìn)一步利用免疫熒光方法觀察p65核轉(zhuǎn)移情況。圖4A顯示,在空白對(duì)照組中p65(紅色熒光)分散在細(xì)胞中,但是在LPS處理組中p65大量向細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)聚集;與LPS處理組相比,DEX和ICAC處理組(20、50、80 mg·L-1)的細(xì)胞核紅色熒光聚集較少。圖4B結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)LPS處理組的細(xì)胞核p65蛋白質(zhì)水平相對(duì)于空白對(duì)照組極顯著上升(P<0.01);與LPS組相比,DEX組和ICAC處理組(20、50、80 mg·L-1)細(xì)胞核p65極顯著下降(P<0.01)。

A.p65核轉(zhuǎn)移免疫熒光檢測(細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色熒光,p65蛋白標(biāo)記為紅色熒光);B.細(xì)胞核p65蛋白質(zhì)相對(duì)β-actin的含量A. Immunofluorescence of p65 nuclear transfer. The nucleus was labeled with blue fluorescence, while p65 proteins were labeled with red fluorescence. B. Nuclear p65 protein content relative to β-actin圖4 ICAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的p65核轉(zhuǎn)移的抑制Fig.4 Inhibition of LPS-induced p65 nuclear transfer by ICAC

2.4 ICAC對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎癥的抑制

采用組織免疫組化方法體內(nèi)證實(shí)ICAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠乳房炎癥的保護(hù)作用。如圖5所示,空白對(duì)照組的乳腺組織形態(tài)表現(xiàn)正常,LPS處理組中的T細(xì)胞標(biāo)記物CD3明顯增多,表明乳腺組織T淋巴細(xì)胞浸潤增多。與LPS處理組相比,DEX對(duì)照組與ICAC處理組的小鼠乳腺組織的T淋巴細(xì)胞浸潤明顯減少,且ICAC處理組比DEX組效果更明顯。

圖5 小鼠乳腺組織CD3免疫組織化學(xué)染色(400×)Fig.5 Immunohistochemical staining (400×) of CD3 in mouse mammary gland tissues

2.5 ICAC對(duì)小鼠乳腺組織NF-κB信號(hào)通路的抑制

利用Western blot檢測小鼠乳腺組織中ICAC對(duì)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵成員p65和IκB的磷酸化影響(圖6)。與對(duì)照組相比,LPS處理后p65和IκB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05,圖6B～C),但是60、80和100 mg·kg-1的 ICAC處理均顯著下調(diào)了LPS誘導(dǎo)的p65和IκB的表達(dá)(P<0.05),而且ICAC處理組中兩種蛋白的表達(dá)量也顯著低于DEX處理組(P<0.05)。同樣,ICAC的處理也顯著降低了p-p65和p-IκB蛋白質(zhì)水平(P<0.05,圖6D～F)。

A. p65和IκB的Western blot條帶;B、C. p65和IκB相對(duì)β-actin的表達(dá)量;D. p-p65和p-IκB的Western blot條帶;E、F. p-p65和p-IκB相對(duì)β-actin的表達(dá)量A. Western blotting for p65 and IκB; B, C. p65/β-actin and IκB/β-actin ratio, respectively; D. Western blotting for p-p65 and p-IκB; E, F. p-p65/β-actin and p-IκB/β-actin ratio, respectively圖6 ICAC對(duì)小鼠乳腺組織NF-κB通路的影響Fig.6 Effect of ICAC on NF-κB pathway in mouse mammary gland tissue

3 討 論

臨床型牛乳腺炎主要由細(xì)菌感染引起奶牛局部以及全身炎癥,最常見的病原體是金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。大腸桿菌引發(fā)的急性臨床癥狀,使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和免疫損傷效應(yīng),包括細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)[25]。LPS是大腸桿菌細(xì)胞壁的主要組成成分,通過TLR4/NF-κB級(jí)聯(lián)激活引起炎癥反應(yīng)[26]。另一方面,MAC-T細(xì)胞是通過轉(zhuǎn)染猴病毒-40的大T抗原后從牛乳腺上皮細(xì)胞中分離出來的;由于MAC-T與原代細(xì)胞具有相似的生物學(xué)反應(yīng),經(jīng)常被用來作為牛乳腺炎的炎癥模型[27]。因此,本研究根據(jù)前期研究采用1 mg·L-1的LPS刺激MAC-T細(xì)胞炎性反應(yīng);通過篩選ICAC處理濃度(圖1),選擇20、50、80 mg·L-1的ICAC探究其對(duì)MAC-T細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響。

先前的研究證明了細(xì)胞因子在細(xì)菌病原體促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的重要作用[27]。LPS誘導(dǎo)的促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β對(duì)牛乳腺組織造成嚴(yán)重?fù)p傷,ICA減輕小鼠自身免疫性關(guān)節(jié)炎和RAW264.7巨噬細(xì)胞中的炎癥[13-14,16]。本研究發(fā)現(xiàn),ICAC降低了LPS誘導(dǎo)的IL-1β和IL-6的表達(dá)量,并且ICAC還抑制了炎癥介導(dǎo)因子COX-2和iNOS的表達(dá)(圖2),證明了ICAC可以減輕LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。COX-2是一種誘導(dǎo)酶,在炎癥反應(yīng)過程中表達(dá)量上調(diào),并且誘導(dǎo)PGE2的表達(dá)[28];iNOS主要在巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)表達(dá),在炎癥反應(yīng)中,iNOS促進(jìn)釋放NO[29-31],說明COX-2和iNOS介導(dǎo)炎癥的發(fā)生,它們的表達(dá)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[15,32]。近期的研究進(jìn)一步證實(shí)ICAC降低EV71感染小鼠腦部IL-6和TNF-α表示水平以及 GSH/GSSG比值和活性氧水平[33];ICAC抑制了高脂肪日糧小鼠巨噬細(xì)胞中iNOS, COX2和IL-1β的表達(dá)[34]。上述結(jié)果證明ICAC具有抗氧化應(yīng)急和抗炎性反應(yīng)的作用。

NF-κB是LPS誘導(dǎo)炎癥過程中經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)路徑,許多植物提取物是通過阻斷NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑來抑制炎癥反應(yīng)[35-37]。NF-κB是細(xì)胞中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子。在靜息狀態(tài)下,位于細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB與IκB結(jié)合而處于無活性狀態(tài)[38]。LPS刺激產(chǎn)生IκBα和p65磷酸化,p-IκBα通過泛素化被降解,釋放出p-p65遷移到細(xì)胞核啟動(dòng)COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎性因子基因的轉(zhuǎn)錄[33]。本研究的體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,ICAC處理降低p-p65和p-IκB的水平,尤其降低p-p65在細(xì)胞核內(nèi)的含量。免疫組化試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),ICAC處理后LPS引起的小鼠乳腺組織T淋巴細(xì)胞浸潤明顯減輕。近期的研究也指出,異綠原酸的抗炎機(jī)制與抑制NLRP3炎性復(fù)合體的形成和NF-κB磷酸化有關(guān)[37]。綜上,ICAC通過抑制IκB和p65磷酸化從而抑制LPS誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺炎性反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究表明,ICAC能降低LPS誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎癥介導(dǎo)因子COX-2和iNOS的表達(dá);ICAC通過抑制NF-κB信號(hào)通路抑制MAC-T細(xì)胞和小鼠乳腺炎癥反應(yīng),但是異綠原酸C在奶牛乳腺炎防治中的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。