孟 璐,胡海燕,董 蕾,鄭 楠,王加啟*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

奶牛乳房炎有感染性或非感染性之分[1],作為奶牛重要的經(jīng)濟(jì)性疾病之一,會(huì)導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量下降及質(zhì)量受到影響,對(duì)動(dòng)物福利也是一個(gè)問(wèn)題[2]。奶牛乳房炎大多由葡萄球菌(Staphylococci)、鏈球菌(Streptococcus)、大腸菌群(coliform)等病原微生物引起[2-3]。在英國(guó),包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)和無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)在內(nèi)的五種細(xì)菌是引起奶牛乳房炎的常見(jiàn)細(xì)菌[4]。Gao等[5]報(bào)道,大腸桿菌、克雷伯菌屬(Klebsiella)、凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococci)、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌是中國(guó)臨床型乳房炎最常分離到的細(xì)菌。因此,確定主要乳房炎病原微生物及來(lái)源,有利于奶牛乳房炎的管理和預(yù)防。

生乳中微生物的組成與牧場(chǎng)環(huán)境或奶牛感染有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),影響生乳的微生物可以從牧場(chǎng)環(huán)境中轉(zhuǎn)移,包括牛群健康、養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖人員衛(wèi)生和飼養(yǎng)方法[6-7]。另有研究表明,墊料[8]、乳頭皮膚[7]、奶杯和藥浴杯[9]是生乳污染的重要來(lái)源。根據(jù)Hogan等[10]的研究,墊料類型和日常管理是影響乳房健康和乳房感染及發(fā)病率的主要因素。此外,Gao等[5]和Song等[11]都發(fā)現(xiàn),在有效防控奶?；既榉垦讜r(shí),中國(guó)牧場(chǎng)應(yīng)注意地區(qū)、季節(jié)和墊料材料等因素。

關(guān)于我國(guó)規(guī)模性牧場(chǎng)乳房炎主要病原微生物的分布及其與牧場(chǎng)環(huán)境之間的關(guān)聯(lián),多數(shù)研究基于培養(yǎng)法進(jìn)行分析[11]。本研究通過(guò)16S rDNA測(cè)序?qū)χ袊?guó)天津某牧場(chǎng)的環(huán)境和乳房炎乳中微生物種類進(jìn)行研究,并利用SourceTracker分析探明乳房炎乳細(xì)菌的潛在來(lái)源,以期為牧場(chǎng)管控提供精準(zhǔn)的靶向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)菌生理鹽水管(帶棉簽,北京華威銳科化工有限公司);營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京陸橋技術(shù)股份有限公司);營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面(北京陸橋技術(shù)股份有限公司);E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(美國(guó)OMEGA公司);Taq PCR Master Mix[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司];PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司];2×Hieff? Robust PCR Master Mix(日本TOYOBO公司);SanPrep DNA凝膠提取試劑盒(中國(guó)SANGON Biotechnology公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

HPS-250生化培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);HDL BSC-136011A2生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);T100 PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司);PowerPac 電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司);Qubit 4.0熒光劑(美國(guó)Life Technologies公司);ABI Step One Plus Real-Time PCR(美國(guó)Life Technologies公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 2019年9—11月在天津某牧場(chǎng)對(duì)單頭病牛乳房炎乳、牧場(chǎng)環(huán)境(空氣、飲用水、飼料、糞便、墊料、新墊料及噴淋水)和擠奶廳(前藥浴液、后藥浴液、前藥浴杯、后藥浴杯、奶杯、乳頭皮膚)進(jìn)行樣品采集,共計(jì)74份,具體樣品信息詳見(jiàn)表1,采樣方法詳見(jiàn)胡海燕等[12]的報(bào)道。

表1 試驗(yàn)樣品匯總Table 1 Summary of tested samples

1.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 用移液槍吸取1 mL液體樣品,在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板涂布,36 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h,之后用20 mL氯化鈉(0.85%)清洗每個(gè)平板,收集所有的細(xì)菌菌落,制備可培養(yǎng)樣品。固體樣品稱取25 g,溶于225 mL氯化鈉(0.85%)中,均質(zhì)1 min后,吸取1 mL液體涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,36 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h,之后用20 mL氯化鈉(0.85%)清洗每個(gè)平板,收集所有的細(xì)菌菌落,制備可培養(yǎng)樣品。

使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit將所有制備好的可培養(yǎng)樣品和非培養(yǎng)樣品提取DNA。DNA的完整性和濃度分別通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Qubit 4.0熒光劑測(cè)量。用于PCR的引物包括V3-V4通用引物341F: CCTACGGGNGGCWGCAG和805R: GACTACHVGGGTATCTAATCC。

1.3.3 16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序 用2%瓊脂糖凝膠提取PCR產(chǎn)物,使用SanPrep DNA凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。擴(kuò)增子通過(guò)ABI Step One Plus Real-Time PCR進(jìn)行定量,并在Illumina平臺(tái)上進(jìn)行成對(duì)末端測(cè)序(PE250)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)CASAVA堿基調(diào)用分析,將Illumina MiseqTM獲得的原始圖像數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為原始測(cè)序讀數(shù),并將結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。原始數(shù)據(jù)首先由PEAR(1.9.3版)進(jìn)行清洗,以獲得高質(zhì)量的清潔讀數(shù)[13]。UPARSE(9.2.64版)被用來(lái)聚類相似度≥97%的操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)[14]。通過(guò)R(3.2版)中的Vegan包(2.0-10版),用Jaccard和bray-curtis距離矩陣計(jì)算進(jìn)行主成分分析(PCA)[15]。QIIME(1.9.1版)被用來(lái)計(jì)算微生物群的豐富性和多樣性[16]。用Mothur(1.30.1版)計(jì)算組間的α多樣性比較[17]。

1.3.5 SourceTracker進(jìn)行病原微生物溯源分析 為追溯乳房炎乳微生物的來(lái)源,將乳房炎乳定為“池(Sink)”樣品,將其他牛舍環(huán)境樣品和擠奶廳樣品設(shè)置為“源(Source)”樣品。使用基于貝葉斯算法的SourceTracker軟件(0.9.8版)確定每個(gè)“源”對(duì)“池”的貢獻(xiàn)程度[18]。數(shù)據(jù)運(yùn)行1 000次,其他參數(shù)為默認(rèn)。

2 結(jié) 果

2.1 16S rDNA測(cè)序概述

每個(gè)樣品的原始序列讀數(shù)為41 190～174 790。清洗后,每個(gè)樣品的序列讀數(shù)為8 777～170 415。此外,OTU數(shù)為61～5 484。

2.2 α多樣性

本試驗(yàn)使用了三個(gè)指標(biāo)(Chao1、Shannon和Simpson指數(shù))來(lái)分別測(cè)量基于培養(yǎng)和非培養(yǎng)樣品中微生物組的α多樣性。由于噴淋水僅有一份,所以未計(jì)算指數(shù)s值且未統(tǒng)計(jì)差異性。

表2 可培養(yǎng)乳房炎乳和牛舍環(huán)境樣品的α多樣性Table 2 Alpha diversity of culture-based samples between mastitis milk and pan

表3 可培養(yǎng)乳房炎乳和擠奶廳樣品的α多樣性Table 3 Alpha diversity of culture-based samples between mastitis milk and

對(duì)于可培養(yǎng)樣品,擠奶廳中奶杯的Chao1指數(shù)最高,其次是乳頭皮膚樣品,而乳房炎乳樣品的Chao1指數(shù)在所有樣品中最低。此外,新墊料樣品的Shannon指數(shù)最高,其次是墊料樣品,乳房炎乳樣品的Shannon指數(shù)也是所有樣品中最低的。

表4 未培養(yǎng)乳房炎乳和牛舍環(huán)境樣品的α多樣性Table 4 Alpha diversity of nonculture-based samples between mastitis milk and pan

表5 未培養(yǎng)乳房炎乳和擠奶廳樣品的α多樣性Table 5 Alpha diversity of nonculture-based samples between mastitis milk and

通過(guò)高通量16S rDNA基因測(cè)序,研究牛舍環(huán)境和擠奶廳對(duì)乳房炎乳的影響,發(fā)現(xiàn)乳房炎乳和牛舍環(huán)境未培養(yǎng)樣品之間以及乳房炎乳和擠奶廳未培養(yǎng)樣品之間細(xì)菌群落的α多樣性出現(xiàn)顯著分離(P<0.05),分析表明擠奶廳樣品中的細(xì)菌群落與乳房炎乳細(xì)菌群落具有更大的相似性,其可能對(duì)乳房炎乳細(xì)菌群落產(chǎn)生影響。

2.3 β多樣性

通過(guò)非度量多維排列(non-metric multidimensional scaling,NMDS)指數(shù)來(lái)區(qū)分OTU結(jié)果,點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離反映了樣品之間的差異程度。

對(duì)于可培養(yǎng)乳房炎乳樣品和牛舍環(huán)境樣品,新墊料樣品和墊料樣品的細(xì)菌群落最相似,而可培養(yǎng)乳房炎乳樣品具有復(fù)雜的細(xì)菌群落(圖1A)。此外,科水平上的ANOSIM分析顯示R值為0.524(P=0.001,圖1B)。

A. 細(xì)菌OTU多樣性概況的非度量多維尺度(NMDS)分析,不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同的組,橫縱坐標(biāo)是相對(duì)距離;B. ANOSIM,科水平上的相似性分析(R=0.524,P=0.001)。M. 乳房炎乳;F. 糞便;NL. 新墊料;L. 墊料;DW. 飲用水;SW. 噴淋水;Fd. 飼料;A. 空氣A. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analyses of the bacterial OTU diversity profiles. Different color or shape points stand for different groups. Horizontal and vertical coordinates is relative distances, which shows no practical meaning; B. ANOSIM, analysis of similarities on family level (R=0.524, P=0.001). M. Mastitis milk samples; F. Feces samples; NL. New bedding material samples; L. Bedding material samples; DW. Drinking water samples; SW. Spray water sample; Fd. Feed samples; A. Air samples圖1 可培養(yǎng)乳房炎乳和牛舍環(huán)境樣品之間的群落差異Fig.1 The community difference among the culture-based mastitis milk samples and the pan barn samples

對(duì)于可培養(yǎng)乳房炎乳和擠奶廳樣品,前藥浴液和后藥浴液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)相似(圖2A),科水平上的ANOSIM分析顯示R值為0.406(P=0.001,圖2B)。

A. 細(xì)菌OTU多樣性概況的非度量多維尺度(NMDS)分析,不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同的組,橫縱坐標(biāo)是相對(duì)距離;B. ANOSIM,科水平上的相似性分析(R=0.406,P=0.001)。M. 乳房炎乳;S. 乳頭皮膚;C. 奶杯;aB. 前藥浴液;bB. 后藥浴液;aBC.前藥浴杯;bBC.后藥浴杯A. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analyses of the bacterial OTU diversity profiles. Different color or shape points stand for different groups. Horizontal and vertical coordinates is relative distances, which shows no practical meaning; B. ANOSIM, analysis of similarities on family level (R=0.406, P=0.001). M. Mastitis milk samples; S. Teat skin samples; C. Teat dip cup; aB. Pre teat medicine samples; bB. Post teat medicine samples; aBC. Pre medicine cup samples; bBC. Post medicine cup samples圖2 可培養(yǎng)乳房炎乳和擠奶廳樣品之間的群落差異Fig.2 The community difference among the culture-based mastitis milk samples and the parlour samples

對(duì)于未培養(yǎng)乳房炎乳和牛舍環(huán)境樣品,NMDS分析顯示糞便樣品、新墊料樣品、墊料樣品和空氣樣品中細(xì)菌群落相似,而未培養(yǎng)乳房炎乳和擠奶廳間的樣品之間存在較大差異(圖3A)?？扑缴系腁NOSIM分析顯示R值為0.503(P=0.001,圖3B)。

A. 細(xì)菌OTU多樣性概況的非度量多維尺度(NMDS)分析,不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同的組,橫縱坐標(biāo)是相對(duì)距離;B. ANOSIM,科水平上的相似性分析(R=0.503,P=0.001)。M. 乳房炎乳;F. 糞便;NL. 新墊料;L. 墊料;DW. 飲用水;SW. 噴淋水;Fd. 飼料;A. 空氣A. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analyses of the bacterial OTU diversity profiles. Different color or shape points stand for different groups. Horizontal and vertical coordinates is relative distances, which shows no practical meaning; B. ANOSIM, analysis of similarities on family level (R=0.503, P=0.001). M. Mastitis milk samples; F. Feces samples; NL. New bedding material samples; L. Bedding material samples; DW. Drinking water samples; SW. Spray water sample; Fd. Feed samples; A. Air samples圖3 未培養(yǎng)乳房炎乳和牛舍環(huán)境樣品之間的群落差異Fig.3 The community difference among the nonculture-based mastitis milk samples and the pan barn samples

對(duì)于未培養(yǎng)乳房炎乳和擠奶廳樣品,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較小(圖4A),科水平上的ANOSIM分析顯示R值為0.361(P=0.001,圖4B)。β多樣性分析說(shuō)明了乳房炎乳和牛舍樣品之間以及乳房炎乳和擠奶廳樣品之間具有差異。

A. 細(xì)菌OTU多樣性概況的非度量多維尺度(NMDS)分析,不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同的組,橫縱坐標(biāo)是相對(duì)距離;B. ANOSIM,科水平上的相似性分析(R=0.361,P=0.001)。M. 乳房炎乳;S. 乳頭皮膚;C. 奶杯;aB. 前藥浴液;bB. 后藥浴液;aBC. 前藥浴杯;bBC. 后藥浴杯A. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analyses of the bacterial OTU diversity profiles. Different color or shape points stand for different groups. Horizontal and vertical coordinates is relative distances, which shows no practical meaning; B. ANOSIM, analysis of similarities on family level (R=0.361, P=0.001). M. Mastitis milk samples; S. Teat skin samples; C. Teat dip cup; aB. Pre teat medicine samples; bB. Post teat medicine samples; aBC. Pre medicine cup samples; bBC. Post medicine cup samples圖4 未培養(yǎng)乳房炎乳和擠奶廳樣品之間的群落差異Fig.4 The community difference among the nonculture-based mastitis milk samples and the parlour samples

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.4.1 可培養(yǎng)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) OTU分析一共鑒定出50個(gè)不同科的微生物。對(duì)于可培養(yǎng)的乳房炎乳樣品(cM1～cM6),僅在cM3和cM5 樣品中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌落,而在其他平板上沒(méi)有生長(zhǎng)。樣品cM3和cM5樣品中的主要細(xì)菌分別是腸桿菌科(Enterobacteriaceae,99.87%)和葡萄球菌科(Staphylococcaceae,94.04%)(圖5A)。本試驗(yàn)中在乳房炎乳樣品中發(fā)現(xiàn)了高比例的不可培養(yǎng)樣品,這個(gè)結(jié)果曾經(jīng)在中國(guó)南方畜群的樣品中被報(bào)道[5]。

對(duì)于可培養(yǎng)的牛舍環(huán)境樣品,芽胞桿菌科(Bacillaceae)在飼料樣品中的豐度最大(56.69%),其次是飲用水(40.46%)和糞便樣品(39.56%);莫拉菌科則在墊料樣品中豐度最大(39.59%),其次為新墊料樣品(33.32%)和噴淋水樣品(6.47%);動(dòng)球菌科則在空氣樣品中豐度最高(53.36%,圖5A)。對(duì)于可培養(yǎng)的擠奶廳樣品,細(xì)菌群落表現(xiàn)出高度相似性(圖5B)。芽胞桿菌科是藥浴液(cB1～cB18)和藥浴杯(cBC1～cBC13)中的優(yōu)勢(shì)菌科,占比超過(guò)50%;而在部分乳頭皮膚樣品(cS3和cS5)和奶杯樣品(cC1和cC5)中則含有大量的動(dòng)球菌科細(xì)菌。

2.4.2 未培養(yǎng)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 對(duì)于未培養(yǎng)的樣品,乳房炎乳樣品(M1～M6)中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(科水平)包括鏈球菌科(Streptococcaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、腸桿菌科、伯克霍爾德菌科(Burkholderiaceae)、莫拉菌科、毛單胞菌科(Comamonadaceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)。M1、M2和M3樣品中主要細(xì)菌分別為鏈球菌(99.85%)、假單胞菌科(89.05%)和腸桿菌科(99.84%),而M4、M5和M6樣品中伯克霍爾德菌科占比較高,分別為14.15%、11.99%和33.25%(圖6A)。

A. 未培養(yǎng)的乳房炎乳和牛舍環(huán)境樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);B. 未培養(yǎng)的乳房炎乳和擠奶廳樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。M. 乳房炎乳;F. 糞便;NL. 新墊料;L. 墊料;DW. 飲用水;SW. 噴淋水;Fd. 飼料;A. 空氣;S. 乳頭皮膚;C. 奶杯;B1～B9. 前藥浴液;B10～B18. 后藥浴液;BC1～BC9. 前藥浴杯;BC10～BC18. 后藥浴杯A. Microbiota community of uncultured-based mastitis samples and pan barn samples; B. Microbiota community of uncultured-based mastitis samples and parlour samples. M. Mastitis milk samples; F. Feces samples; NL. New bedding material samples; L. Bedding material samples; DW. Drinking water samples; SW. Spray water sample; Fd. Feed samples; A. Air samples; S. Teat skin samples; C. Teat dip cup; B1-B9. Pre teat medicine samples; B10-B18. Post teat medicine samples; BC1-BC9. Pre medicine cup samples; BC10-BC18. Post medicine cup samples圖6 未培養(yǎng)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(科水平)Fig.6 Microbiota community of uncultured-based samples at family level

對(duì)于未培養(yǎng)的牛舍樣品,優(yōu)勢(shì)菌科是不同的。瘤胃球菌科(12.44%)的平均豐度最高,其次是莫拉菌科(12.01%)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae,8.63%)。然而,不同的樣品中的細(xì)菌群落不同。在糞便(F1～F6)樣品中,瘤胃球菌科細(xì)菌比例最高,其次是毛螺菌科(Lachnospiraceae)、卟啉單胞菌科(Porphyromonadaceae)和消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)。此外,空氣樣品(A1～A3)中,莫拉菌科是豐度最高的科,占55%以上,其次是假單胞菌科和根瘤菌科(Rhizobiacea,圖6A)。對(duì)于未培養(yǎng)的擠奶廳樣品,瘤胃球菌科(12.36%)、莫拉菌科(7.20%)和毛螺菌科(7.00%)的豐度最高。擠奶廳樣品中科水平的細(xì)菌多樣性比較高。前藥浴液樣品(B1～B9)中莫拉菌科的豐度最高(24.50%),其次是毛螺菌科(7.97%)。然而,后藥浴液(B10～B18)中,瘤胃球菌科和莫拉菌科細(xì)菌豐度最高,B13樣品中芽胞桿菌科數(shù)量較多,占38.88%。在前藥浴杯(BC1-BC9)和后藥浴杯(BC10～BC18)樣品,瘤胃球菌科和伯克霍爾德菌科的豐度更高(圖6B)。

2.5 使用SourceTracker進(jìn)行源頭分析

在本研究中,利用SourceTracker分析未培養(yǎng)的乳房炎乳中細(xì)菌的潛在來(lái)源(圖7)。其中,乳頭皮膚中細(xì)菌與乳房炎乳中細(xì)菌的相似性較高,為19.06%,其次是空氣(15.47%)、藥浴杯(14.43%)和糞便(10.36%)。此外,仍有部分乳房炎乳中細(xì)菌來(lái)源不明,因此,需要開(kāi)展進(jìn)一步的研究,以確定病原微生物的最可能來(lái)源,從源頭降低污染。

圖7 乳房炎乳中病原微生物的不同來(lái)源貢獻(xiàn)率Fig.7 Pie charts of the percentages of inferred sources of mastitis milk microbiota

3 討 論

本研究旨在通過(guò)高通量16S rDNA基因測(cè)序,探討牛舍環(huán)境及擠奶廳對(duì)奶牛乳房炎的影響。此外,α多樣性表明了牛舍環(huán)境和乳房炎乳樣品之間以及擠奶廳和乳房炎乳樣品之間的細(xì)菌存在顯著差異(P<0.05)。此外,β多樣性分析表明了來(lái)自牛舍環(huán)境樣品的細(xì)菌群落與擠奶廳樣品的細(xì)菌群落之間差異。

與之前使用傳統(tǒng)方法比較乳房炎細(xì)菌與農(nóng)場(chǎng)環(huán)境之間關(guān)聯(lián)的研究相反[5,11],作者不僅關(guān)注平板可培養(yǎng)的細(xì)菌多樣性,還關(guān)注非培養(yǎng)樣品中的細(xì)菌多樣性。本研究表明樣品中的微生物群存在差異,一些樣本明顯以一個(gè)屬為主,而另一些樣本則表現(xiàn)出多樣化的特征。在乳房炎乳樣本中發(fā)現(xiàn)了陰性培養(yǎng)樣本,這些樣本也存在于中國(guó)南方的畜群中[5]。芽胞桿菌科I、動(dòng)球菌科和莫拉菌科是可培養(yǎng)的牛舍環(huán)境和擠奶廳樣品中最主要的科,尤其是在藥浴液和藥浴杯中。Fursova等[19]發(fā)現(xiàn)患病動(dòng)物中的芽胞桿菌科增加,但動(dòng)球菌科的百分比下降。動(dòng)球菌科是健康奶牛和牛腸道中的主要細(xì)菌,因此可能是糞便細(xì)菌中的主要菌群[20-21]。Nguyen等[22]發(fā)現(xiàn)莫拉菌科和動(dòng)球菌科是墊料和空氣塵埃微生物群中排名前20的細(xì)菌類群,并且兩者的相對(duì)豐度都呈季節(jié)性變化(夏季>冬季)。

分類結(jié)果表明,腸桿菌科是本試驗(yàn)中可培養(yǎng)和未培養(yǎng)乳房炎乳樣品M3的優(yōu)勢(shì)菌科。然而,乳房炎乳樣品M5中的優(yōu)勢(shì)菌科不同,分別是可培養(yǎng)樣品中的葡萄球菌科和未培養(yǎng)樣品中的伯克霍爾德菌科。盡管不同國(guó)家和地區(qū)乳房炎乳中病原微生物的優(yōu)勢(shì)菌群存在差異,但本研究結(jié)果與Fursova等[19]的結(jié)果一致。他們?cè)诙砹_斯中部的動(dòng)物乳房炎乳中檢測(cè)到假單胞菌科、伯克霍爾德菌科以及鏈球菌科、葡萄球菌科和芽胞桿菌科。Bi等[23]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、克雷伯菌、黏質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)和化膿性弧菌(Vibriopyogenes)是中國(guó)奶牛群中常見(jiàn)的乳房炎病原微生物。此外,很多研究也關(guān)注了伯克霍爾德菌科在人類和動(dòng)物乳房炎乳中的變化。與人類亞急性乳房炎和健康乳房相比,急性乳房炎乳樣品中的氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、伯克霍爾德菌科、布魯氏菌科(Brucellaceae)和鏈球菌科的水平顯著更高[24]。Gmez-Valdez等[25]發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德菌科在母乳樣品中的相對(duì)豐度平均值更高[9.0%±11.7% (0% ～48.6%范圍)]。此外,在第5周哺乳期母乳中伯克霍爾德菌科的相對(duì)豐度較高且值非常高[26]。

總體而言,未培養(yǎng)樣品中的細(xì)菌群落組成更為豐富。瘤胃球菌科是所有糞便樣品和很多藥浴液樣品中豐度最高的菌科,這與其他研究一致。Nguyen等[22]報(bào)道瘤胃球菌科(34.1%)、擬桿菌科(Bacteroidaceae,10.2%)、毛螺菌科(9.6%)、理菌科(Rikenellaceae,3.3%)和梭菌科(Clostridiaceae,2.9%)是糞便中豐富最高的五個(gè)菌科,并且與季節(jié)無(wú)關(guān)。此外,瘤胃球菌科也是夏季和冬季墊料樣品細(xì)菌群落中豐度最高的五個(gè)分類群之一。Wu等[8]也證明瘤胃球菌科是典型的糞便細(xì)菌類群。瘤胃球菌科已被證明與牛乳房炎顯著相關(guān)[27]。

莫拉菌科是空氣樣品中豐度最高的科,其可引起人類呼吸系統(tǒng)疾病[28]。莫拉菌科在空氣灰塵中的細(xì)菌群落中排名第二,在墊料細(xì)菌群落中排名第三[22]。此外,莫拉菌科在牛奶樣品、墊料樣品、沙土樣品、稻殼樣品和被用作奶牛墊料的糞便堆肥樣品中均存在[29]。雖然只有一個(gè)噴淋水樣品,但其中細(xì)菌群落豐度最高的是毛單胞菌科,這與其他樣品完全不同。毛單胞菌科廣泛存在于淡水生境中[30]。Rault等[31]報(bào)道稱,在健康的乳頭細(xì)菌群落中發(fā)現(xiàn)了毛單胞菌科。然而毛單胞菌科不是與乳房炎相關(guān)的病原體[32],并且在不同的感染狀態(tài)間存在差異[33]。

高通量宏基因組學(xué)結(jié)合SourceTracker算法已被用于追溯不同環(huán)境中細(xì)菌群落的變化[18],這可能有助于闡明細(xì)菌群落從環(huán)境到奶牛的傳播[7]。在本研究中,作者發(fā)現(xiàn)乳頭皮膚、空氣、藥浴杯和糞便是乳房炎乳細(xì)菌群落的主要貢獻(xiàn)者。本研究與Verdier-Metz等[34]一致,他們發(fā)現(xiàn)乳頭皮膚是生乳細(xì)菌群落的來(lái)源。Doyle等[35]還發(fā)現(xiàn)乳頭皮膚是生乳細(xì)菌群落的最大貢獻(xiàn)者,其次是糞便,這表明生乳細(xì)菌群落受牧場(chǎng)管理的影響。此外,Wu等[8]發(fā)現(xiàn)牛奶細(xì)菌群落與空氣中的細(xì)菌群落有關(guān),而Du等[9]研究表明藥浴杯和奶杯是生乳中微生物的最重要貢獻(xiàn)者。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)16S rDNA測(cè)序結(jié)合SourceTracker分析了乳房炎乳中細(xì)菌群落與牛舍環(huán)境和擠奶廳樣品中細(xì)菌群落的相似性,這將對(duì)闡明乳房炎乳細(xì)菌群落與牛舍環(huán)境和擠奶廳細(xì)菌群落的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)擠奶廳樣品,尤其是乳頭皮膚,對(duì)乳房炎乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有影響,因此,應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)擠奶廳的衛(wèi)生管理與操作規(guī)范,從源頭降低乳及乳制品中微生物引起的質(zhì)量與安全風(fēng)險(xiǎn)。