韓坤良,蘭 偉,胡 新,崔亞東,孔祥峰*

(1.阜陽(yáng)師范大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,阜陽(yáng) 236037;2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410125)

機(jī)體內(nèi)氧化-還原水平失衡是眾多疾病的病理生理基礎(chǔ)[1],家禽生產(chǎn)中的大部分問題均與氧化應(yīng)激有關(guān)。隨著產(chǎn)蛋日齡的增加,產(chǎn)蛋后期蛋雞機(jī)體內(nèi)發(fā)生代謝紊亂和氧化應(yīng)激[2],對(duì)其生產(chǎn)性能、機(jī)體健康和產(chǎn)品質(zhì)量等均會(huì)產(chǎn)生不利影響[3]。因此,通過營(yíng)養(yǎng)手段增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化性能,對(duì)保障蛋雞正常生產(chǎn)具有重要意義。中藥的優(yōu)點(diǎn)包括無有害殘留、毒副作用小和不易產(chǎn)生耐藥性等,可促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,是一類綠色飼料添加劑[4]?，F(xiàn)有研究顯示,飼糧添加蒲公英可增加蛋雞血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及總抗氧化能力(T-AOC),降低丙二醛(MDA)含量[5];添加女貞子提取物可顯著降低肉雞肝MDA含量,提高肝SOD活性[6];添加丹參可增加肉雞血清T-AOC,降低MDA含量[7]。筆者以“涼血利尿、祛瘀調(diào)經(jīng)”為組方原則,選用一定比例的益母草、女貞子、蒲公英和丹參等中藥材組方后進(jìn)行超微粉碎,發(fā)現(xiàn)飼糧添加0.5%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英的超微粉后,試驗(yàn)1～30 d蛋雞產(chǎn)蛋率顯著增加7.56%、料蛋比顯著降低4.98%,31～60 d產(chǎn)蛋率顯著增加4.00%,61～90 d平均日采食量顯著增加6.37%,1～120 d產(chǎn)蛋率顯著增加5.31%;飼糧添加0.3%益母草+0.2%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英后,試驗(yàn)1～30和61～90 d蛋雞平均日采食量分別顯著增加3.91%和6.56%,試驗(yàn)1～120 d產(chǎn)蛋率顯著增加5.22%[8]。這些復(fù)方中藥超微粉是否能夠通過改善產(chǎn)蛋后期蛋雞機(jī)體抗氧化性能來發(fā)揮上述效果尚不清楚。因此,本文研究了復(fù)方中藥超微粉對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞機(jī)體抗氧化性能的影響,并從抗氧化信號(hào)通路方面探討其作用機(jī)理,為其作為飼料添加劑用于蛋雞生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、分組及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選用216只307日齡的健康新楊黑羽蛋雞隨機(jī)分為3組,每組8個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)9只。試驗(yàn)開始前各組產(chǎn)蛋率和體重均無顯著差異。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加復(fù)方1(0.5%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英)、復(fù)方2(0.3%益母草+0.2%丹參+0.25%女貞子+0.25%蒲公英)的超微粉。試驗(yàn)所用中藥購(gòu)自阜陽(yáng)藥材加工廠。中藥復(fù)方制劑超微粉碎后過300目篩,其主要成分為多糖、多酚、黃酮、氨基酸、脂肪酸、微量元素和色素等物質(zhì)[6,9]?；A(chǔ)飼糧參照NRC(1994)蛋雞營(yíng)養(yǎng)需要配制,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。預(yù)試期7 d,正試期120 d。試驗(yàn)期間每天光照16 h,自由飲水,每天喂食2次(09:00、15:00)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets (air-dry basis) %

1.2 樣品采集與處理

分別于試驗(yàn)第60和120天,每組隨機(jī)選取8只體重相近且健康狀態(tài)良好的蛋雞,禁飼12 h(不禁飲水)后稱重,翅靜脈采血5 mL,肝素抗凝,3 500 r·min-1離心10 min分離血漿樣品-20 ℃保存,用于氧化-抗氧化指標(biāo)測(cè)定;頸動(dòng)脈放血處死,采集肝組織樣品,液氮速凍后-80 ℃保存,用于氧化-抗氧化指標(biāo)測(cè)定及相關(guān)基因表達(dá)量的分析。

1.3 血漿與肝氧化-抗氧化指標(biāo)測(cè)定

稱取肝組織0.100 0 g,加入9倍冰冷的PBS溶液,置于EP管中研磨,2 500 r·min-1離心10 min,取上清液。取血漿和肝組織勻漿上清液,采用ELISA試劑盒(上海滬宇生物科技有限公司)測(cè)定GSH-Px、CAT和SOD活性,采用生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定MDA含量和T-AOC,按照試劑盒說明書在酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO)上測(cè)定。

1.4 肝組織相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè)

取肝組織液氮研磨,TRIzol法提取總RNA,用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度,用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,用PCR儀(LightCycler? 480II,Roche)檢測(cè)抗氧化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。20 μL反應(yīng)體系包括:2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1),cDNA 0.8 μL,ddH2O 8.4 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火/延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表2。用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列Table 2 Primer sequences used for real-time fluorescence quantitative PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016整理后采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05為差異顯著,0.05≤P<0.10為有變化趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方中藥超微粉對(duì)蛋雞血漿氧化-抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知,試驗(yàn)第60天,復(fù)方1組和2組血漿SOD活性和MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05);試驗(yàn)第120天,復(fù)方2組血漿CAT活性和MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),復(fù)方1組血漿CAT活性和MDA含量顯著低于復(fù)方2組(P<0.05)。

表3 復(fù)方中藥超微粉對(duì)蛋雞血漿氧化-抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of compound Chinese herb ultrafine powder on plasma oxidant-antioxidant indexes of laying hens

2.2 復(fù)方中藥超微粉對(duì)蛋雞肝組織氧化-抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知,試驗(yàn)第60天,與對(duì)照組相比,復(fù)方1組和2組肝組織GSH-Px、SOD和CAT活性以及T-AOC顯著增加(P<0.05),復(fù)方1組肝組織MDA含量顯著降低(P<0.05);與復(fù)方1組相比,復(fù)方2組肝組織GSH-Px活性和T-AOC顯著增加、SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)。試驗(yàn)第120天,與對(duì)照組相比,復(fù)方1組和2組肝組織GSH-Px、SOD和CAT活性顯著增加(P<0.05),復(fù)方1組MDA含量顯著降低(P<0.05);與復(fù)方1組相比,復(fù)方2組肝組織GSH-Px活性顯著增加、CAT活性顯著降低(P<0.05)。

表4 復(fù)方中藥超微粉對(duì)蛋雞肝組織氧化-抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of compound Chinese herb ultrafine powder on liver oxidant-antioxidant indexes of laying hens

2.3 復(fù)方中藥超微粉對(duì)蛋雞肝組織抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

由圖1可知,試驗(yàn)第60天,與對(duì)照組相比,復(fù)方1組蛋雞肝組織NQO1和GST的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),復(fù)方2組肝組織GSH-Px2、GSH-Px3、GSH-Px4、SOD2、SOD3、TXNRD1、TXNRD3、NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)、SOD1的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05);與復(fù)方1組相比,復(fù)方2組肝組織GSH-Px2、GSH-Px3、GSH-Px4、SOD2、SOD3、TXNRD1、TXNRD3、NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào),CAT和GST的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。試驗(yàn)第120天,與對(duì)照組相比,復(fù)方2組肝組織Nrf2和GSH-Px2的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)、GSH-Px1的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05);與復(fù)方1組相比,復(fù)方2組肝組織Nrf2、GSH-Px2、TXNRD1和TXNRD3的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。

A. 試驗(yàn)第60天肝抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量;B.試驗(yàn)第60天肝抗氧化相關(guān)信號(hào)通路基因mRNA表達(dá)量;C.試驗(yàn)第120天肝抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量;D.試驗(yàn)第120天肝抗氧化相關(guān)信號(hào)通路基因mRNA表達(dá)量。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. mRNA expression of liver antioxidant-related gene on day 60; B. mRNA expression of liver antioxidant related signaling pathway gene on day 60; C. mRNA expression of liver antioxidant related genes on day 120; D. mRNA expression of liver antioxidant related signaling pathway genes on day 120. Bars with different letters mean significant difference (P<0.05)圖1 復(fù)方中藥超微粉對(duì)蛋雞肝組織抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.1 Effect of compound Chinese herb ultrafine powder on the liver mRNA expression of antioxidant related genes in laying hens

3 討 論

MDA是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物,其含量反映了機(jī)體氧化損傷的程度;GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶是機(jī)體抗氧化損傷的第一道防線,它們可共同反映機(jī)體抗氧化的潛力[10]。本試驗(yàn)中,飼糧添加中藥復(fù)方2后血漿CAT活性顯著增加,添加中藥復(fù)方1和2后血漿MDA含量呈先降低后升高趨勢(shì),說明試驗(yàn)前期機(jī)體抗氧化性能增強(qiáng),試驗(yàn)后期蛋雞自由基產(chǎn)生較多,可能與試驗(yàn)后期蛋雞體內(nèi)抗氧化酶類活性下降、自由基累積引起脂質(zhì)過氧化[11]、損傷細(xì)胞功能[12]有關(guān)。有報(bào)道表明,飼糧添加蒲公英[5]和益母草[13]可增加蛋雞血漿GSH-Px、CAT、SOD和T-AOC水平,降低MDA含量。這與本試驗(yàn)結(jié)果不盡一致,可能與中草藥的配伍和添加劑量有關(guān),具體原因還需要進(jìn)一步研究。

肝組織的抗氧化指標(biāo)是反映蛋雞機(jī)體健康狀況的重要指標(biāo)[14-15]。本試驗(yàn)中,飼糧添加中藥復(fù)方1和2后肝組織GSH-Px、SOD、CAT活性和T-AOC均有所增加、MDA含量有所降低,說明肝組織清除自由基的能力增強(qiáng),可能是因?yàn)橐婺覆輀16]、女貞子[17]、蒲公英[18]和丹參[19]等中藥中含有的多糖、黃酮類物質(zhì)可有效提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化水平。張金漢等[20]報(bào)道,飼糧添加女貞子等中藥可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋雞肝組織T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活性,降低MDA含量;洪玲玲等[6]研究表明,飼糧添加女貞子可增加肉雞肝組織SOD活性、降低肝組織MDA含量,這與本研究結(jié)果一致。

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路可抵抗機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng),正向調(diào)控下游相關(guān)抗氧化蛋白酶的合成,被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路[21];GPXs和TXNRD是動(dòng)物體內(nèi)兩種重要的抗氧化系統(tǒng)[22],GST、HO-1和NQO 1均是必不可少的解毒酶,在清除體內(nèi)ROS等有害物質(zhì)中發(fā)揮重要作用[23]。本試驗(yàn)中,飼糧添加中藥復(fù)方1第60天肝NQO1的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào),添加中藥復(fù)方2第60天肝GSH-Px2、GSH-Px3、GSH-Px4、SOD2、SOD3、TXNRD1、TXNRD3、NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào),與肝組織GSH-Px活性的增加趨勢(shì)一致;添加中藥復(fù)方2第120天蛋雞肝組織Nrf2和GSH-Px2的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào),與肝組織中T-AOC、GSH-Px和CAT等抗氧化酶活性的增加趨勢(shì)一致,提示機(jī)體的抗氧化性能增強(qiáng)。這可能是因?yàn)橐婺覆輀16]、女貞子[17]、蒲公英[18]和丹參[19]等中藥中的黃酮類物質(zhì)能夠激活Keap1/-Nrf2/ARE、Nrf2/HO-1信號(hào)通路[24],增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力[25]。

4 結(jié) 論

綜上所述,在本試驗(yàn)條件下,飼糧添加由益母草、丹參、女貞子和蒲公英組成的復(fù)方中藥超微粉可通過增加血漿和肝組織抗氧化酶活性、激活肝組織相關(guān)抗氧化信號(hào)通路增強(qiáng)蛋雞的抗氧化能力,且兩個(gè)復(fù)方對(duì)機(jī)體抗氧化能力的調(diào)控作用具有靶標(biāo)特異性。