鄭先瑞,卓明雪,紀(jì)金麗,蔣維虎,鄧在雙,張吉成,田雅莉,丁月云,張曉東,殷宗俊*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,合肥 230036;2.地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230036)

動物胃腸道中含有種類繁多、數(shù)量巨大的微生物菌群。研究表明,哺乳動物胃腸道的微生物群,大約由1014個菌種組成[1],這些微生物菌群與動物體相互影響、相互依存、相互作用,構(gòu)成了動物體的腸道微生態(tài)系統(tǒng)。

皖南黑豬是國家級保護(hù)品種(https://www.cdad-is.org.cn/admin/Login/index.html),具有耐粗飼、肉質(zhì)鮮美、繁殖力強(qiáng)、早熟遲衰、產(chǎn)仔數(shù)多等優(yōu)點。但與引進(jìn)雜交豬品系相比,存在生長速度緩慢、瘦肉率低等問題,影響這些問題的因素主要為遺傳、飼料、環(huán)境、飼養(yǎng)管理等,而這些因素也正是影響腸道菌群的重要原因[2]。Tan等[3]對育肥期高、低飼料利用率豬個體間腸道菌群進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)腸道微生物在菌屬水平上表現(xiàn)出差異,這些差異菌屬可作為區(qū)分飼料效率差異的生物標(biāo)記物,說明通過調(diào)控腸道微生物組來提高豬育肥期的生長性能可能是一種可行的策略。斷奶期間的高發(fā)病率(如腹瀉)和死亡率,與腸道微生物組失衡有關(guān)[4],通過益生菌調(diào)節(jié)豬腸道微生物組以保持健康的微生物組是預(yù)防病原體和促進(jìn)有益細(xì)菌豐度的一種有效手段[5]。郭曉紅等[6]研究表明,仔豬結(jié)腸微生物菌群結(jié)構(gòu)與組成在不同品種、不同生長發(fā)育階段均存在顯著差異,對仔豬免疫性能具有重要作用。曹志鵬等[7]研究表明,藏仔豬糞便微生物菌群結(jié)構(gòu)在不同生長發(fā)育階段存在差異,隨著藏仔豬的生長,其對營養(yǎng)物質(zhì)的降解能力和腸道免疫能力提高。綜上所述,豬腸道微生物是動態(tài)變化的,且腸道微生物組與豬關(guān)鍵生長階段的健康狀況和生產(chǎn)性能之間密切相關(guān)。盡管前人研究極大地擴(kuò)展了人們對豬腸道微生物組的理解,但腸道微生物多樣性在皖南黑豬這一優(yōu)良地方豬品種的不同生長階段是如何變化的?不同生長時期優(yōu)勢菌群和主要功能菌群的具體作用是什么?目前尚未見相關(guān)的研究報道,且多項研究證實,通過將地方豬種糞菌移植到商品豬種體內(nèi)可以使受試豬種表現(xiàn)出與供體豬種相似的腸道微生物區(qū)系及表型性狀[8],說明了研究地方豬腸道微生物多樣性具有理論及實踐意義。

因此,本研究采集哺乳期、保育期和育肥期皖南黑豬的糞便及血液樣本,通過分析不同階段皖南黑豬腸道微生物和血清免疫指標(biāo)的縱向變化,以期初步揭示皖南黑豬腸道微生物多樣性及其與生長發(fā)育的相關(guān)性,挖掘目的菌群在豬抗病力及生長發(fā)育等方面的作用,對后期提高皖南黑豬機(jī)體健康水平和提升畜產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與樣本采集

試驗豬由安徽省廣德市三溪生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供。選取同品種、體重和日齡相近的純種健康皖南黑豬母豬,在相同的環(huán)境條件及飼養(yǎng)管理下,根據(jù)不同的生長階段選擇相應(yīng)的飼糧進(jìn)行飼喂,本研究中的試驗豬從出生至試驗結(jié)束均未接受抗生素治療。

本試驗在哺乳期(P,20 d)、保育期(B,60 d)和育肥期(Y,120 d)3個不同生長階段分別篩選出9頭體重和體型基本一致的個體豬進(jìn)行糞便的采集,取糞便中心位置,混勻后放入5 mL凍存管,立即投入液氮罐,運回實驗室及時提取樣品DNA,共計27頭。同時對3個不同生長階段的豬進(jìn)行頸部采血,采集后的血液置于10 mL非抗凝采血管中低溫保存,采集后的血液樣本放入低速離心機(jī)中,3 500 r·min-1離心10 min,吸取血清于新的離心管中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血清生化指標(biāo)檢測

將保存的血清樣本取出后,分別購買相應(yīng)的ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),通過Synergy H1/H1MFD多功能酶標(biāo)儀(BioTek,美國)檢測血清中的免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、內(nèi)毒素(LPS)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的含量。

1.3 樣品總DNA提取和16S rRNA基因測序分析

使用OMEGA Soil DNA Kit(D5625-01,美國)試劑盒提取糞便樣品DNA,并通過分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳方法檢測DNA純度、濃度及質(zhì)量。對質(zhì)檢合格的樣本構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域PCR體系并進(jìn)行純化,利用特異性引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌16S rRNA基因的V3和V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,再使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences,美國)回收目的片段。利用Ouant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對純化后的PCR產(chǎn)物在Microplate reader(BioTekFLx800)上進(jìn)行定量,然后按照每個樣品所需的數(shù)據(jù)量進(jìn)行混樣。測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司協(xié)助完成。首先利用Illumina公司的TruSeg Nano DNA LT Library Prep Kit進(jìn)行建庫,然后將質(zhì)檢合格的文庫在通過Illumina NovaSeg平臺進(jìn)行2×250bp雙端測序。

1.4 微生物多樣性、組成和物種差異性分析

使用DADA2[9]方法對測序得到的原始數(shù)據(jù)(input)進(jìn)行去引物、質(zhì)量過濾、去噪(denoise)、拼接和去嵌合體,得到用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)。以100%相似度聚類,產(chǎn)生的每個去重的序列稱為ASVs(amplicon sequence variants, ASVs)。采用QIIME2(version 2019.4)軟件[10]的classify-sklearn算法(https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier)和Silva[11]數(shù)據(jù)庫(Release132, http://www.arb-silva.de)的默認(rèn)參數(shù)及預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器對每個ASVs的特征序列進(jìn)行物種分類注釋?；贏SVs表分析結(jié)果,使用QIIME2(version 2 019.4)軟件、R語言中的ggplot2作圖軟件包統(tǒng)計個樣品在97%相似度水平下的Chao1、Observed specides、Shannon、Simpson和Coverage指數(shù)。通過分析物種稀疏曲線判斷測序深度的合理性。使用R語言軟件對皖南黑豬糞便菌群在門和屬水平進(jìn)行物種組成及PCoA分析。使用Python LEfSe包、R語言中的ggtree軟件包等進(jìn)行LEfSe(LDA effect size)分析,獲得皖南黑豬不同發(fā)育階段產(chǎn)生顯著影響的微生物菌屬。

1.5 豬腸道菌群與血清指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

使用R軟件GGally包對血清免疫指標(biāo)與腸道差異菌屬進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過計算環(huán)境因子與所選菌屬之間的Spearman等級相關(guān)系數(shù),將獲得的數(shù)值通過ComplexHeatmap包進(jìn)行熱圖可視化。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel統(tǒng)計,使用IBM SPSS Statistics(v26.0)軟件對不同日齡間血清免疫指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬不同生長階段血清免疫指標(biāo)分析

血清檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清中某些免疫指標(biāo)隨著日齡的增加而發(fā)生顯著變化,如圖1所示,血清中LPS與IL-6在哺乳期濃度相對較高,在育肥期濃度相對最低。仔豬哺乳期LPS濃度極顯著高于保育期和育肥期(P<0.01);血清中IL-6濃度則是隨著仔豬日齡的增加而出現(xiàn)逐漸降低的趨勢,其中哺乳期IL-6濃度極顯著高于育肥期(P<0.01),保育期IL-6濃度顯著高于育肥期(P<0.05)。此外,在仔豬生長過程中,血清中IgA、IgG濃度則是呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,兩者均在保育階段達(dá)到高峰期,其中IgG在哺乳期濃度較低,極顯著低于保育期(P<0.01)。血清中的IgM濃度則隨著仔豬的生長呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,各階段IgM濃度差異不顯著。綜上分析,皖南黑豬在生長發(fā)育過程中,機(jī)體的免疫水平會隨著日齡等因素的改變而發(fā)生相應(yīng)變化。

A. LPS含量;B. IL-6含量;C. IgA含量;D. IgG含量;E. IgM含量。ns. 差異不顯著(P>0.05);*.差異顯著(P<0.05);**、***. 差異極顯著(P<0.01、P<0.001)。P、B、Y分別代表哺乳期、保育期和育肥期。下同A. LPS content; B. IL-6 content; C. IgA content; D. IgG content; E. IgM content. ns. No significant difference (P>0.05); *(P<0.05), ** and ***(P<0.01) indicate significant difference among different stages. P, B and Y represent the lactation period, nursery period and fattening period, respectively. The same as below 圖1 不同階段皖南黑豬各項血清免疫指標(biāo)柱狀圖Fig.1 Histogram of serum indices for Wannan Black pig at different stages

2.2 16S rRNA測序質(zhì)量評估

基于ASVs(amplicon sequence variants)水平進(jìn)行稀釋曲線分析,通過Shannon稀釋曲線如(圖2A)和Chao1稀釋曲線如(圖2B)結(jié)果表明,稀釋曲線趨向平緩并最終達(dá)到平臺期,說明此次測序深度達(dá)到研究標(biāo)準(zhǔn),測序結(jié)果能充分反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性,樣品測序深度能覆蓋腸道中的大部分菌種,結(jié)果可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖2 27個樣品Shannon稀釋曲線圖(A)和Chao1 稀釋曲線圖(B)Fig.2 Shannon dilution curve (A) and Chao1 dilution curve (B) for 27 samples

2.3 菌群聚類分析

本研究共采集3個不同生長階段共27頭皖南黑豬糞便樣本,通過分析各樣品ASVs的共有情況,從而鑒定出不同日齡皖南黑豬的主要微生物菌群。如圖3所示,三組共有的ASVs有781個。哺乳期、保育期及育肥期特有的ASVs分別為7 221個、14 101個及12 311個。

圖3 ASVs韋恩圖Fig.3 ASVs Venn diagram

2.4 不同日齡皖南黑豬腸道菌群組成分析

根據(jù)分類學(xué)結(jié)果如(圖4)所示,在門水平上共檢測到22個核心菌門,其中哺乳期、保育期和育肥期分別鑒別到15、19和18個核心門水平菌。通過不同階段豬腸道微生物菌群在門水平中的分布情況,發(fā)現(xiàn)哺乳期腸道中的優(yōu)勢菌門為Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Fusobacter,其中Actinobacteria和Fusobacter是哺乳期的特有菌門。通過對不同日齡間在門水平上的聚類情況進(jìn)行分析(圖5),發(fā)現(xiàn)保育期和育肥期豬腸道菌群結(jié)構(gòu)存在交叉現(xiàn)象,說明保育期和育肥期的腸道菌群在門水平上其組成及豐度相似度較高。保育期和育肥期的優(yōu)勢菌門均為Firmicutes、Bacteroidetes和Spirochaetes,其中Spirochaetes在哺乳期結(jié)束后大量定植。

圖4 不同階段腸道菌群門水平柱狀分布圖Fig.4 Horizontal columnar distribution of intestinal flora at phylum level during different stages

圖5 不同階段間腸道菌群門水平層次聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis diagram of intestinal flora at phylum level during different stages

在門水平菌群豐富度方面,各階段腸道菌群均以Firmicutes和Bacteroidetes為優(yōu)勢菌門,其中在哺乳期平均豐度值分別為65.3%、10.5%,在保育期平均豐度值分別為84.4%、10.9%,在育肥期平均豐度值分別為87.4%、8.5%。此外,Proteobacteria在哺乳期平均豐度值為4.41%,顯著高于其他生長階段(保育期:0.62%,育肥期:0.20%)。由此可以看出,Firmicutes的豐度值隨著豬日齡增長而逐漸升高,而Proteobacteria豐度值則隨著豬日齡增長而顯著下降。

在屬水平上共檢測到51個核心菌屬,其中哺乳期、保育期和育肥期分別鑒別到44、49和49個核心屬水平菌,其中篩選出前20的顯著菌屬進(jìn)行展示。如圖6所示,哺乳期的優(yōu)勢菌屬為Lactobacillus、Shigella和Faecalibacterium。通過對不同日齡間在屬水平上的聚類情況進(jìn)行分析,結(jié)果如圖7,發(fā)現(xiàn)保育期和育肥期的菌群在屬水平上其組成及豐度仍相近,保育期和育肥期的優(yōu)勢菌屬均以Lactobacillus、Oscillospira和Treponema為主。

圖6 不同階段腸道菌群屬水平柱狀分布圖Fig.6 Horizontal columnar distribution of intestinal flora at genus level during different stages

圖7 不同階段間腸道菌群屬水平層次聚類分析圖Fig.7 Cluster analysis diagram of intestinal flora at genus level during different stages

在屬水平菌群豐富度方面,各階段腸道菌群均以Lactobacillus為優(yōu)勢菌屬,Lactobacillus在哺乳期豐度為47.38%,在保育豬豐度為25.92%,在育肥豬豐度為43.47%。此外,在哺乳豬腸道中相對豐度>2%的菌屬有Lactobacillus、Shigella、Faecalibacterium和Bacteroides,在保育豬腸道中相對豐度>2%的菌屬有Lactobacillus、Oscillospira和Treponema,在育肥豬腸道中相對豐度>2%的菌屬有Lactobacillus、Oscillospira、Treponema和Faecalibacterium。

根據(jù)不同日齡腸道菌群在屬水平上的組成差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)哺乳期豬腸道中的Lactobacillus和Faecalibacterium含量高于保育期和育肥期,保育豬腸道中的Oscillospira和Streptococcus含量高于哺乳期和育肥期,育肥豬腸道中的Prevotella和Blautia含量略高于哺乳期和保育期。此外,Shigella和Bacteroides在哺乳期出現(xiàn),屬于哺乳期的次要優(yōu)勢菌屬。Treponema、Ruminococcaceae-Ruminococcus、Streptococcus、Coprococcus、SMB53、Dorea和芽殖菌屬(Gemmiger)在仔豬斷奶后開始大量定植。

2.5 皖南黑豬腸道微生物多樣性分析

通過Alpha多樣性分析結(jié)果如(圖8),在哺乳期、保育期和育肥期三個不同生長階段,其覆蓋率Coverage指數(shù)分別在98.88%、98.21%和98.05%,說明本次測序覆蓋了樣品中所包含98%以上的物種。在Chao1指數(shù)方面,哺乳期相較最低,保育期和育肥期腸道菌群物種數(shù)最為相近,均與哺乳期存在極顯著差異(P<0.01)。在Observed specides豐富度指數(shù)方面,哺乳期與保育期存在極顯著差異(P<0.001),與育肥期存在極顯著差異(P<0.01)。在Shannon和Simpson多樣性方面,保育期菌群多樣性指數(shù)最高,其次為育肥期。通過Shannon指數(shù)發(fā)現(xiàn),哺乳期與保育期存在極顯著差異(P<0.001),與育肥期存在極顯著差異(P<0.01)。在Simpson指數(shù)方面,哺乳期與保育期存在顯著差異性(P<0.05)。綜上得出,保育期和育肥期菌群豐度及多樣性方面最為接近,而哺乳期與之相比相對較低。

根據(jù)PCoA結(jié)果顯示如(圖9A),腸道菌群在三個生長階段發(fā)生了顯著變化。哺乳期腸道菌群明顯單獨聚為一類,其各樣本間距離較小,整體分布較為集中,說明在哺乳期各樣本間腸道菌群的組內(nèi)差距不大。保育期及育肥期各樣本間距離較遠(yuǎn)且分布較疏散,說明保育期各樣本間腸道菌群的組內(nèi)存在較大差異。但可看出保育期及育肥期腸道菌群組成相似且聚在一起,而與哺乳期腸道菌群沒有交疊,說明它們與哺乳期腸道菌群差距較大。

圖9 腸道菌群的PCoA分析圖(A)和NMDS分析圖(B)Fig.9 PCoA analysis diagram (A) and NMDS analysis diagram (B) of intestinal flora

通過NMDS分析結(jié)果如(圖9B),哺乳期樣本間微生物群落的差異最小,隨著日齡的增加,同樣可看出,保育期和育肥期腸道菌群組成有交疊,說明組間差異小,而與哺乳期組間差異較大。

2.6 不同日齡皖南黑豬腸道菌群差異性分析

為準(zhǔn)確分析皖南黑豬不同日齡腸道的特定微生物分類群,本研究利用LEfSe分析法來反映樣本組之間特異性細(xì)菌類群的富集情況。結(jié)果表明,不同日齡間共存在100個組間差異核心菌群,其中45個在哺乳期中富集,34個在保育期中富集,21個在育肥期中富集。通過分支圖(圖10)可以看出哺乳期的差異項明顯多于保育期及育肥期。根據(jù)LDA分析結(jié)果如(圖11),哺乳期豐度差異顯著的菌群主要有放線菌(Actinobacteria)、紅椿菌目(Coriobacteriales)、紅椿菌科(Coriobacteriaceae)、紅蝽菌綱(Coriobacteriia)、梭菌屬科(Fusobacteriaceae)、梭桿菌屬(Fusobacteria)、梭菌屬目(Fusobacteriales)、Proteobacteria、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、Shigella、Faecalibacterium、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、Bacteroides等45個特異性菌群;保育期豐度差異顯著的菌群主要有Clostridia、Clostridiales、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、Oscillospira、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、螺旋體門(Spirochaetes)、螺旋體目(Spirochaetales)、螺旋體科(Spirochaetaceae)、Treponema、鏈球菌科(Streptococcaceae)、Streptococcus等34個特異性菌群;與育肥期豐度差異相關(guān)的菌群主要有Firmicutes、Ruminococcaceae-Ruminococcus、毛顫菌科(Lachnospiraceae)、隱球菌(Anaerofustis)、Coprococcus等21個特異性菌群。

圖10 不同階段腸道菌群物種差異進(jìn)化分支圖Fig.10 Different evolutionary clades of intestinal flora species at different stages

圖11 不同階段差異物種LDA值分布柱狀圖Fig.11 Histogram of LDA value distribution of different species at different stages

2.7 腸道菌群與血清指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

本研究基于高通量測序技術(shù)及多變量統(tǒng)計學(xué)方法找出與宿主免疫力密切相關(guān)的腸道菌群,通過對豐度前30的腸道菌屬與血清指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),血清中的LPS、IL-6、IgA、IgG、IgM濃度均與豬腸道菌群存在相關(guān)性。

通過對不同生長階段腸道菌群與血清免疫細(xì)胞的相關(guān)性熱圖分析(圖12)發(fā)現(xiàn),與LPS濃度密切相關(guān)的菌種有7個,其中Shigella與LPS濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),Bifidobacterium和Campylobacteri與LPS濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),Prevotella、Ruminococcus和Eubacterium與LPS濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),Dorea與LPS濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。與IL-6濃度密切相關(guān)的菌種有5個,其中Shigella與IL-6濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),Bacteroides與IL-6濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),Prevotella和Catenibacterium與IL-6濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),Faecalibacterium與IL-6濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

*表示顯著性差異(P<0.05);**表示極顯著差異(P<0.01)* and ** indicate significant difference among different stages (*P<0.05; **P<0.01 )圖12 腸道菌群與血清指標(biāo)相關(guān)性熱圖Fig.12 Heat map of correlation between intestinal flora and serum indices

此外,通過對腸道菌群與血清免疫蛋白相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),與IgA密切相關(guān)的菌種有7個,其中Dorea、Butyricicoccus和Coprococcus與IgA濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。Butyricimonas與IgA濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),Megasphaera、三角藻屬(Mitsuokella)和Bacteroides與IgA濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。與IgG濃度密切相關(guān)的菌種有16個,其中Dorea與IgG濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),Ruminococcus、Butyricicoccus、Treponema、Streptococcus、Eubacterium和Coprococcus與IgG濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),另枝菌屬(Alistipes)和Butyricimonas與IgG濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),Olsenella、Megasphaera、Bifidobacterium、夏普氏菌屬(Sharpea)、毛螺菌科_梭菌屬(Lachnospiraceae_Clostridium)、Mitsuokella和Bacteroides與IgG濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。與IgM濃度密切相關(guān)的菌種有11個,其中Catenibacterium和Faecalibacterium與IgM濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),Prevotella、Blautia、Ruminococcaceae_uminococcus、Gemmiger和Oribacterium與IgM濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.05),Bifidobacterium、Sharpea、Bacteroides和Mitsuokella與IgM濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

腸道微生物影響宿主的生長、新陳代謝和免疫功能[12-13]。糞便微生物可以反映腸道微生物的組成,且越來越多研究者通過新鮮糞便的微生物組成來研究腸道微生物區(qū)系[14]。本研究通過Illumina NovaSeq測序平臺對皖南黑豬不同生長階段的腸道微生物測序分析發(fā)現(xiàn)其多樣性十分豐富,并通過物種差異分析揭示了不同階段的優(yōu)勢菌群,將本研究結(jié)果與前人腸道微生物相關(guān)研究進(jìn)行了深入比較分析。Firmicutes和Bacteroidetes是皖南黑豬的主要優(yōu)勢菌門,與前人豬腸道微生物的相關(guān)研究結(jié)論是一致的[15-17],Lim等[18]揭示豬腸道菌群多樣性的演變是與年齡成正相關(guān),郭曉紅等[6]揭示了仔豬的腸道菌群也是隨著年齡變化的。皖南黑豬不同日齡的腸道菌群相互關(guān)聯(lián),物種間的演變也是共同進(jìn)化,這與前人的研究結(jié)果類似[7,19]。以上都說明了本研究結(jié)果是可靠的,可以為腸道微生物的研究及我國地方豬的優(yōu)良特性挖掘提供參考。

隨著仔豬的生長發(fā)育,不同日齡腸道微生物的豐度也會隨之發(fā)生變化,這與豬不同生長階段的生理特性是對應(yīng)的[20]。本研究中,Firmicutes的豐度隨著豬日齡的增長而逐漸升高,而Proteobacteria的豐度則隨著豬日齡增長出現(xiàn)顯著下降。有關(guān)文獻(xiàn)報道,Firmicutes與脂肪沉積存在相關(guān)性,而Proteobacteria與蛋白質(zhì)發(fā)酵存在關(guān)聯(lián)[21-23]。由此推測,可能是皖南黑豬哺乳期高蛋白的攝入造就了腸道中高豐度的Proteobacteria,而斷奶后飼料成分及機(jī)體生長發(fā)育的影響則加速了Firmicutes的定植。Firmicutes能有效吸收食物中的熱量,進(jìn)而加快脂肪沉積,育肥期腸道內(nèi)Firmicutes的出現(xiàn)可能與機(jī)體生長性能有關(guān)[24]。Lactobacillus是皖南黑豬的主要優(yōu)勢菌屬。有研究報道,Lactobacillus在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng),增強(qiáng)腸道功能代謝以及維持腸道微生物菌群平衡方面存在一定的潛力[25]。本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)仔豬斷奶后腸道內(nèi)的Lactobacillus出現(xiàn)些微下降,但隨著保育期飼養(yǎng)結(jié)束后,腸道中的Lactobacillus又出現(xiàn)些許升高,這可能由于從哺乳期到育肥期的生長過渡期間,仔豬的采食方式由原先的吮吸母乳轉(zhuǎn)變?yōu)檩^難消化吸收的固態(tài)顆粒飼料,而腸道菌群在此階段還未建立完善所致[26]。

本研究中,特異性菌群主要有Actinobacteria、Coriobacteriaceae、Fusobacteriaceae、Fusobacteria、Proteobacteria、Enterobacteriaceae和Shigella。有研究提示,當(dāng)腸道中Actinobacteria豐度越高,則越有利于脂肪的沉積[27]。Mccormack等[5]研究也發(fā)現(xiàn),豬腸道中的Actinobacteria豐度與飼料利用率高低存在關(guān)聯(lián)。早先研究報道,Fusobacteria是宿主體內(nèi)的共生菌,能夠維持結(jié)腸上皮組織的動態(tài)平衡[28]。而哺乳期Enterobacteriaceae的出現(xiàn)可能是母乳中Enterococcus的菌株從母體轉(zhuǎn)移到子體所致[29]。此外,有文獻(xiàn)報道,高豐度的Proteobacteria會使腸道菌群出現(xiàn)失調(diào)現(xiàn)象,進(jìn)而引發(fā)豬腸道菌群的炎癥[30]。而Shigella與Proteobacteria作為腸道致病菌,容易引起仔豬腹瀉不利于仔豬健康生長[31]。有報道發(fā)現(xiàn),Clostridia、Clostridiales都是和宿主免疫相關(guān)的菌群[32-33]。而本研究發(fā)現(xiàn),Oscillospira、Christensenellaceae作為益生菌在保育期出現(xiàn),這可能與該階段豬自身免疫功能開始增強(qiáng),腸道內(nèi)環(huán)境逐漸趨向均衡有關(guān)。張冬杰等[34]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中粗纖維的含量將直接引起Treponema的變化,本研究中保育階段腸道內(nèi)出現(xiàn)的Treponema則很有可能與飼料中粗纖維含量有關(guān)[35]。育肥期出現(xiàn)了較多的益生菌,如Ruminococcus、Lachnospiraceae和Coprococcus,而這些有益菌在維持腸道健康方面發(fā)揮重要作用[36]。

研究報道,豬體內(nèi)最大的黏膜免疫器官是腸道黏膜,而腸道黏膜細(xì)胞內(nèi)分泌最多的免疫球蛋白多以IgA、IgG和IgM為主[37]。本研究發(fā)現(xiàn),Dorea、Butyricicoccus和Coprococcus與血清中的IgA、IgG濃度均存在顯著相關(guān)性。據(jù)研究報道,Coprococcus可以協(xié)助短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,進(jìn)而間接地起到抗炎、保護(hù)腸屏障功能等作用[38]。此外,Ruminococcaceae-Ruminococcus、Treponema、Streptococcus和Eubacterium也與IgG濃度存在顯著相關(guān)性,Catenibacterium、Faecalibacterium、Prevotella和Blautia與IgM濃度存在顯著相關(guān)性。研究表明,Ruminococcus、Treponema、Prevotella、Eubacterium和Blautia都是短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌,其能夠直接或間接地起到抗炎、保護(hù)腸道屏障功能和免疫等作用[39]。本研究結(jié)果顯示,與血清中的IgA、IgG、IgM濃度存在顯著正相關(guān)的菌群多達(dá)17個,皖南黑豬不同生長階段血清中的IgA、IgG、IgM 濃度在機(jī)體中的水平不盡相同,保育期和育肥期整體水平波動不大,而哺乳期相對略低,說明仔豬斷奶后腸道菌群在抗炎癥及機(jī)體抵抗力方面都相應(yīng)的有所提升,這也在一定程度上驗證了豬腸道菌群可以影響宿主的生長性狀及健康狀況。

4 結(jié) 論

本研究以中國優(yōu)良地方豬皖南黑豬為研究對象,利用16S rDNA測序方法,探討了哺乳期、保育期及育肥期皖南黑豬腸道微生物的變化。皖南黑豬糞便菌群以擬桿菌門和厚壁菌門為主,且隨日齡增長呈逐漸增高的趨勢,在保育期達(dá)到最高值,隨后在育肥期趨向穩(wěn)定,此外,皖南黑豬糞便中的有益菌在斷奶后開始增多。血清中免疫生化指標(biāo)LPS、IL-6、IgA、IgG、IgM濃度均與豬腸道菌群存在相關(guān)性,其中LPS和IL-6濃度在哺乳期最高,IgA、IgG濃度在保育期達(dá)到峰值,IgM濃度在育肥期最高。差異菌群(屬水平)和免疫因子之間的相互作用可能也是影響皖南黑豬生長發(fā)育的重要因素之一。本研究揭示的皖南黑豬的腸道微生物菌群及不同階段的優(yōu)勢菌群,可為深入理解豬不同階段的生理特性、挖掘地方豬的優(yōu)良特性及生產(chǎn)管理提供一定的理論參考。