王棟梁,任 靜,郝琴琴,李鵬飛*

(1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,朔州 036002;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

牛在發(fā)情周期內(nèi)通常只有一個(gè)卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵受精,絕大多數(shù)卵泡會(huì)在發(fā)育過(guò)程中走向閉鎖,過(guò)度的卵泡閉鎖嚴(yán)重制約著胚胎工程的應(yīng)用及優(yōu)良種畜擴(kuò)繁[1]。可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide, CART)是下丘腦分泌的內(nèi)源性神經(jīng)肽,參與調(diào)控?cái)z食、藥物成癮及激素分泌等多種生物過(guò)程[2-4]。研究表明,CART是牛卵泡發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[5],體外培養(yǎng)牛卵泡顆粒細(xì)胞(granulosa cells, GCs)發(fā)現(xiàn),添加CART可顯著抑制促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)誘導(dǎo)的GCs中雌激素(estrogen, E2)的分泌,GCs中芳構(gòu)化酶CYP19A1 mRNA表達(dá)量減少,因此認(rèn)為CART在牛卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[6]。

真核生物的基因表達(dá)極為復(fù)雜,可大致分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,其中細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控最為經(jīng)濟(jì)有效,轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控依賴(lài)基因啟動(dòng)子和特異性轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。Shobatake等[7]報(bào)道,人CART啟動(dòng)子區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子GATA2、GATA3結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步研究表明干擾上述兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)能夠消除由間歇性缺氧誘導(dǎo)的CARTmRNA水平上調(diào)。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn),人CART啟動(dòng)子和內(nèi)含子中均含有1個(gè)NRSF結(jié)合位點(diǎn)(NRSE),轉(zhuǎn)錄因子NRSF通過(guò)招募共阻遏復(fù)合物抑制CART表達(dá),且NRSF對(duì)內(nèi)含子NRSE的親和力高于啟動(dòng)子NRSE。有研究發(fā)現(xiàn),給予可卡因刺激后,大鼠伏隔核中CART和轉(zhuǎn)錄因子CREB含量增加,ChIP試驗(yàn)證明CREB直接與CART啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄[9-10]。本課題組前期致力于篩選并鑒定位于牛卵泡GCs膜上的能夠與CART特異性結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用的G蛋白偶聯(lián)受體[11-12],而目前對(duì)于牛CART轉(zhuǎn)錄因子鑒定及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究也鮮有報(bào)道。

本研究利用PCR擴(kuò)增、生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)對(duì)牛CART基因核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析與鑒定;DNA pull down篩選能夠與CART基因核心啟動(dòng)子區(qū)特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,并通過(guò)體外試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)牛CART基因核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響,為進(jìn)一步完善牛下丘腦CART基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),分析并闡明CART基因調(diào)控卵泡發(fā)育的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

山西文水縣肉牛屠宰場(chǎng)選擇3頭正常發(fā)情的健康西門(mén)塔爾母牛,采集下丘腦組織后,投入滅菌DPBS中洗滌后液氮速凍,帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 試驗(yàn)試劑

人胚胎腎上皮細(xì)胞(293T)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存;組織基因組DNA提取試劑盒(天根);2×TaqPCR Master Mix(中科瑞泰);限制性?xún)?nèi)切酶KpnI、SmaI,TB Green? Premix ExTaqTMII(TaKaRa);pGL3-Basic載體、pRL-TK載體(Promega);pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen);TransIntroTMEL(全式金);DNA pull down(伯信)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)分析 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取牛CART(GenBank登錄號(hào):NM_001007820)基因組DNA序列,選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site, TSS)上、下游啟動(dòng)子區(qū)域1 222 bp作為研究對(duì)象,利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)、MethPrimer數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)潛在的CpG島位置;利用New PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析啟動(dòng)子上順式作用元件位點(diǎn)。

1.3.2 基因組DNA提取 根據(jù)組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)從牛下丘腦組織中抽提DNA,Nanodrop超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度及純度后,置于-20 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 利用Primer Premier 5.0針對(duì)CART啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,交由公司合成,引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.3.4 重組載體構(gòu)建及雙熒光素酶活性檢測(cè) 根據(jù)順式作用元件位點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子序列5′端進(jìn)行截短,具體截短長(zhǎng)度及位置見(jiàn)圖1,在截短片段上、下游分別引入KpnI和SmaI酶切位點(diǎn),交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。利用限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和SmaI對(duì)pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,選取陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序,重組質(zhì)粒分別命名為pGL3-314(-292 bp～+22 bp)、pGL3-497(-475 bp～+22 bp)、pGL3-827(-805 bp～+22 bp)、pGL3-1222(-1 200 bp～+22 bp)。

圖1 牛CART基因啟動(dòng)子5′端截短示意圖Fig.1 Schematic diagram of bovine CART gene promoter 5′truncated promoter

將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞并用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)每個(gè)樣品中螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性,螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值即為熒光素酶相對(duì)活性(relative luciferase activity, RLA)。

1.3.5 DNA pull down試驗(yàn) 針對(duì)CART核心啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)5′端生物素標(biāo)記探針,交由伯信公司合成,NC探針選擇編碼β-半乳糖苷酶的LacZ基因。提取牛下丘腦組織核蛋白,Bradford法測(cè)定樣品濃度,-80 ℃保存。上述生物素標(biāo)記的目的探針和NC探針?lè)謩e與鏈霉親和素磁珠25 ℃結(jié)合1 h,向磁珠-探針混合物中加入核蛋白樣品,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育結(jié)合1 h。洗脫收集蛋白復(fù)合物,SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。從考染后的膠塊上切下差異條帶,進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.3.6 質(zhì)譜鑒定與數(shù)據(jù)處理 使用Orbitrap ExplorisTM480質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,液相所用A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。取1 μg酶解后的蛋白膠條由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Zorbax 300SB-C18 peptide traps,再經(jīng)由色譜柱RP-C18進(jìn)行分離,色譜柱以95%的A液進(jìn)行平衡,流速為300 nL·min-1。分離梯度為:0～50 min,B液線(xiàn)性梯度4%～50%;50～54 min,B液線(xiàn)性梯度50%～100%;54～60 min,B液維持在100%。Q Exactive質(zhì)譜儀對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。

Proteome Discover2.4對(duì)原始文件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,數(shù)據(jù)庫(kù)為Bos taurus-ensembl-fasta,酶解方式為胰蛋白酶,固定修飾為Carbamidomethy,可變修飾為M Oxidation、Acetyl。TBtools繪制韋恩圖并獲取差異蛋白列表,Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://geneontology.org/)對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO富集分析,KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)分析差異蛋白參與的信號(hào)通路,AnimalTFDB 3.0在線(xiàn)分析數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子與核心啟動(dòng)子互作分析。

1.3.7 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CART啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響 NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取牛RFX5(GenBank登錄號(hào):XM_010803041)、CREB基因(GenBank登錄號(hào):NM_174285)、RFX1(GenBank登錄號(hào):XM_024994860)、JUND(GenBank登錄號(hào):NM_001103253)、TEAD4(GenBank登錄號(hào):XM_010805630)、TFAP2D(GenBank登錄號(hào):NM_001192329)、RELA(GenBank登錄號(hào):NM_001080242)序列,與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒連接構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;根據(jù)上述序列設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)錄因子與β-actin定量引物,交由公司合成,引物信息見(jiàn)表1。

轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)載體分別與牛CART核心啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,Trizol提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)情況,反應(yīng)體系為:cDNA模板1 μL,TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 s;定量PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線(xiàn):95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參基因,2-△△CT值計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)染48 h后,雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞RLA。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),通過(guò)GraphPad Prism 9.0軟件統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,采用單因素方差分析比較CART截短啟動(dòng)子活性,采用t檢驗(yàn)分析轉(zhuǎn)錄因子與CART核心啟動(dòng)子結(jié)合性各組間的差異,P>0.05表示無(wú)顯著差異,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牛CART基因啟動(dòng)子區(qū)序列擴(kuò)增

以下丘腦基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增牛CART基因候選啟動(dòng)子區(qū)域,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到單一清晰、與目的產(chǎn)物一致的特異性擴(kuò)增條帶(圖2),測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物與NCBI GenBank中牛CART基因序列一致,表明已成功獲得牛CART基因1 222 bp的啟動(dòng)子序列。

M. DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1～3.牛CART基因啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL2000 marker; 1-3. PCR products of promoter for bovine CART gene圖2 牛CART基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplified product of promoter of bovine CART gene

2.2 牛CART基因啟動(dòng)子區(qū)序列特征分析

序列分析結(jié)果顯示,牛CART基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)A堿基為256個(gè)(20.95%),T堿基為325個(gè)(26.60%),G堿基為298個(gè)(24.39%),C堿基為343個(gè)(28.07%)。牛CART基因TSS可能位于翻譯起始位點(diǎn)ATG上游22 bp處的A堿基(記為+1),利用EMBOSS和MethPrimer數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)分析CpG島位點(diǎn),篩選標(biāo)準(zhǔn)為:GC%>50%、Island size>100以及Obs/Exp>0.60,結(jié)果顯示牛CART基因啟動(dòng)子區(qū)含有1個(gè)CpG島,位于-239 bp～-35 bp(205 bp)(圖3A)。順式作用元件位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,存在2個(gè)TATA box,分別位于-28～-21 bp和-846～-840 bp;8個(gè)CAAT box,分別位于-147～-142 bp、-809～-806 bp、-868～-865 bp、-896～-892 bp、-1 046～-1 043 bp、-1 087～-1 082 bp、-1 121～-1 118 bp和-1 166～-1 162 bp(圖3B)。

A. CpG島位點(diǎn)分析;B. 順式作用元件位點(diǎn)預(yù)測(cè)A. Analysis of CpG island sites; B. Prediction of cis-acting element sites圖3 牛CART基因啟動(dòng)子序列特征分析Fig.3 The sequence characteristic analysis of bovine CART gene promoter

2.3 牛CART基因核心啟動(dòng)子區(qū)鑒定

雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示,截短重組載體相對(duì)熒光活性均顯著高于pGL-Basic對(duì)照載體,其中pGL-314的相對(duì)熒光活性顯著高于pGL-497(圖4),表明-292 bp～+22 bp內(nèi)可能存在正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,該區(qū)域?yàn)榕ART基因轉(zhuǎn)錄所需的最短核苷酸序列,即牛CART基因的近端核心啟動(dòng)子區(qū)。

*. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05。下同*. P<0.05; **. P<0.01; ns. P>0.05. The same as below圖4 牛CART基因啟動(dòng)子截短片段相對(duì)熒光活性檢測(cè)Fig.4 Detection of the relative fluorescence activity of bovine CART gene promoter truncated fragments

2.4 DNA pull down篩選核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子

DNA pull down產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分離及考馬斯亮藍(lán)染色,結(jié)果顯示對(duì)照組(NC)與試驗(yàn)組(DPD)在40～55 ku間存在2條差異條帶(圖5)。質(zhì)譜分析去除各組中特異性肽段數(shù)≤2的蛋白質(zhì)后,DPD組獲得互作蛋白921個(gè),去除與NC組有交集的143個(gè)蛋白質(zhì)后,共獲得778個(gè)與NC組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(圖6)。

圖5 差異性互作蛋白篩選Fig.5 Screening of differentially interacting proteins

圖6 差異蛋白韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential proteins

2.5 互作蛋白功能分析

GO功能富集分析顯示,778個(gè)蛋白質(zhì)中有15個(gè)具有DNA結(jié)合功能(圖7A);KEGG分析顯示,差異蛋白涉及的10條主要的信號(hào)通路包括:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、癌癥發(fā)生、神經(jīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、免疫調(diào)節(jié)、糖代謝、翻譯、轉(zhuǎn)錄和能量代謝(圖7B),其中RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA共7個(gè)蛋白質(zhì)具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,且均與牛CART核心啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(表2)。

A.分子功能富集分析;B.信號(hào)通路分析A. Molecular function enrichment analysis; B. Signaling pathway analysis圖7 差異蛋白功能分析Fig.7 Functional analysis of differential proteins

表2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of transcription factor binding sites

2.6 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CART基因核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

pcDNA3.1(+)-轉(zhuǎn)錄因子重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-RFX5、pcDNA3.1(+)-CREB、pcDNA3.1(+)-RFX1、pcDNA3.1(+)-JUND、pcDNA3.1(+)-TEAD4、pcDNA3.1(+)-TFAP2D、pcDNA3.1(+)-RELA后,細(xì)胞中相應(yīng)的候選轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平均極顯著提高(P<0.01)(圖8),表明轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)各轉(zhuǎn)錄因子對(duì)牛CART基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的影響,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)RFX5、RFX1、TEAD4后,293T細(xì)胞相對(duì)熒光活性顯著下降(P<0.05);過(guò)表達(dá)CREB、RELA后293T細(xì)胞相對(duì)熒光活性極顯著上升(P<0.000 1);過(guò)表達(dá)JUND、TFAP2D對(duì)293T細(xì)胞相對(duì)熒光活性無(wú)顯著變化(P>0.05)(圖9)。

A. RFX5過(guò)表達(dá)檢測(cè);B. CREB過(guò)表達(dá)檢測(cè);C. RFX1過(guò)表達(dá)檢測(cè);D. JUND過(guò)表達(dá)檢測(cè);E. TEAD4過(guò)表達(dá)檢測(cè);F. TFAP2D過(guò)表達(dá)檢測(cè);G. RELA過(guò)表達(dá)檢測(cè)。***. P<0.001; ****. P<0.000 1,下同A. Overexpression detection of RFX5; B. Overexpression detection of CREB; C. Overexpression detection of RFX1; D. Overexpression detection of JUND; E. Overexpression detection of TEAD4; F. Overexpression detection of TFAP2D; G. Overexpression detection of RELA. ***. P<0.001; ****. P<0.000 1, the same as below圖8 293T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)檢測(cè)Fig.8 Detection of transcription factors overexpression in 293T cells

A. RFX5組相對(duì)熒光活性檢測(cè);B. CREB組相對(duì)熒光活性檢測(cè);C. RFX1組相對(duì)熒光活性檢測(cè);E. JUND相對(duì)熒光活性檢測(cè);F. TEAD4組相對(duì)熒光活性檢測(cè);G. TFAP2D組相對(duì)熒光活性檢測(cè);H. RELA組相對(duì)熒光活性檢測(cè)A. Relative fluorescence activity of RFX5 group; B. Relative fluorescence activity of CREB group; C. Relative fluorescence activity of RFX1 group; E. Relative fluorescence activity of JUND group; F. Relative fluorescence activity of TEAD4 group; G. Relative fluorescence activity of TFAP2D group; H. Relative fluorescence activity of RELA group圖9 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)牛CART基因核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.9 Effects of transcription factors on transcriptional activity of bovine CART gene core promoter

3 討 論

包裹在卵泡外周的GCs為卵母細(xì)胞發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并通過(guò)分泌E2促進(jìn)卵泡成熟和排卵[13],GCs凋亡是引起卵泡閉鎖的主要原因[14]。研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)肽CART通過(guò)下丘腦-垂體-卵巢軸作用于GCs,抑制E2分泌[15],E2水平降低是卵泡閉鎖的主要特征之一[16],低濃度的E2促進(jìn)GCs凋亡[17]。前期對(duì)牛優(yōu)勢(shì)卵泡(dominant follicles, DFs)和從屬卵泡(subordinate follicles, SFs)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),CART在DFs中表達(dá)量顯著高于SFs,且主要在GCs層表達(dá),認(rèn)為CART通過(guò)促進(jìn)CGs凋亡來(lái)影響E2分泌,進(jìn)而對(duì)卵泡發(fā)育發(fā)揮抑制作用[18]。本課題組對(duì)CART在牛下丘腦表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)bta-miR-377可與CART3′UTR區(qū)結(jié)合抑制CARTmRNA轉(zhuǎn)錄[19]。為進(jìn)一步完善CART表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),本研究對(duì)牛CART基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入探究。

啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵區(qū)域,轉(zhuǎn)錄因子與該區(qū)域內(nèi)的順式作用元件結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或抑制作用。Yamada等[20]克隆獲得人CART基因啟動(dòng)子序列,對(duì)TSS上游1 072 bp的序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)-156 bp處的基因多態(tài)性位點(diǎn)與肥胖遺傳相關(guān)。Dominguez等[21]構(gòu)建小鼠DNA文庫(kù),對(duì)CART基因測(cè)序鑒定后發(fā)現(xiàn)在近端啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)存在cAMP反應(yīng)元件等多種順式作用元件,且人和小鼠CART基因-320 bp～+1 bp區(qū)同源性高達(dá)83%。Ling等[22]分析豬CART5′端缺失啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)錄起始活性,確定-217 bp～+152 bp為豬CART轉(zhuǎn)錄起始所需的最短序列,即豬CART基因核心啟動(dòng)子區(qū)。本研究從牛下丘腦組織中擴(kuò)增獲得牛CART基因啟動(dòng)子片段,構(gòu)建4個(gè)不同截短長(zhǎng)度的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體,篩選并鑒定CART基因核心啟動(dòng)子區(qū),明確-292 bp～+22 bp區(qū)為牛CART基因核心啟動(dòng)子區(qū)。CpG島通過(guò)甲基化影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合能力,在真核生物基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[23-24]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,牛CART基因CpG島位于核心啟動(dòng)子區(qū),認(rèn)為CART基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能受到CpG島甲基化的影響。

CREB是目前研究較為廣泛的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子,主要參與調(diào)控神經(jīng)元反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[25],可通過(guò)磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[26],前人研究表明CREB激活大鼠下丘腦CART表達(dá)[10],本研究同樣明確CREB對(duì)牛下丘腦CART轉(zhuǎn)錄發(fā)揮激活作用。RFX家族可與主要組織相容性抗原MHC Ⅱ類(lèi)基因特異性結(jié)合影響機(jī)體免疫性應(yīng)答,在真核生物的各類(lèi)細(xì)胞中廣泛表達(dá)并發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄激活作用[27-28]。RFX轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于真核生物的各個(gè)組織中,通過(guò)與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用,進(jìn)而影響癌癥發(fā)生發(fā)展[29-30]。RFX1是已知的具有雙向活性的轉(zhuǎn)錄因子[31];王娜等[32]研究表明,干擾神經(jīng)元中RFX5表達(dá)導(dǎo)致Pcdhα基因水平顯著上調(diào),表明RFX5具有抑制基因轉(zhuǎn)錄的功能,本研究則發(fā)現(xiàn)RFX5可顯著降低CART核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,因此認(rèn)為RFX5具有與RFX1相似的雙向轉(zhuǎn)錄活性。TEAD4可與轉(zhuǎn)錄輔助激活因子YAP/TAZ結(jié)合發(fā)揮共激活作用,參與調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路并影響癌癥發(fā)生[33-34],另有研究發(fā)現(xiàn),TEAD4參與介導(dǎo)PI3K/AKT 信號(hào)通路,促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移[35],還可在肝癌細(xì)胞中抑制p27基因的表達(dá)[36]。本研究篩選獲得的轉(zhuǎn)錄因子JUND、TFAP2D和RELA均已被證明具有雙向轉(zhuǎn)錄活性[37-40]。綜上所述,轉(zhuǎn)錄因子在不同細(xì)胞中對(duì)不同基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方向有所不同,僅根據(jù)前人研究成果判斷某轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用易導(dǎo)致結(jié)果偏差。本研究應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA 7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與牛CART基因核心啟動(dòng)子區(qū)的靶向結(jié)合關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證,初步明確RFX5、RFX1、TEAD4抑制牛CART核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性;CREB與RELA增強(qiáng)牛CART核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。本研究未針對(duì)牛下丘腦細(xì)胞及動(dòng)物活體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能驗(yàn)證,后續(xù)將開(kāi)展定點(diǎn)突變及細(xì)胞功能試驗(yàn),并設(shè)計(jì)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子靶向藥物進(jìn)行動(dòng)物活體試驗(yàn),探究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)牛下丘腦CART分泌及卵泡發(fā)育的影響,進(jìn)一步明確各轉(zhuǎn)錄因子與CART核心啟動(dòng)子區(qū)的靶向結(jié)合位點(diǎn)及相互作用關(guān)系。

4 結(jié) 論

本研究擴(kuò)增獲得牛CART基因啟動(dòng)子序列,預(yù)測(cè)該片段上存在CpG島等多種涉及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件,確定-292 bp～+22 bp為CART核心啟動(dòng)子區(qū),構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)載體并明確RFX5、RFX1、TEAD4為牛CART基因轉(zhuǎn)錄抑制因子,CREB與RELA為轉(zhuǎn)錄激活因子。上述結(jié)論為進(jìn)一步揭示牛下丘腦CART轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。