陳相龍 ，趙 楊 ，黃瓊?cè)~ ，徐銘卿 ，李 悅 ，陸 超 ，孫魯寧 ，王永慶 #b（1.徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點實驗室，江蘇 徐州 10004；.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥理研究室，南京1009；.江蘇省婦幼保健院兒科，南京 1006）

早產(chǎn)兒呼吸暫停（apnea of prematurity，AOP）是指早產(chǎn)兒呼吸暫停時間超過20 s，或呼吸暫停持續(xù)時間不足20 s 但伴有皮膚青紫、心動過緩、血氧下降等情況[1]，嚴(yán)重者會導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重缺氧，從而引起并發(fā)癥，甚至死亡。

咖啡因是預(yù)防和治療AOP的首選藥物，與其他甲基黃嘌呤類藥物相比，咖啡因的半衰期更長，治療范圍更廣，成本效益更高[2—3]?？Х纫蛑饕?jīng)肝臟代謝，可生成茶堿、可可堿和副黃嘌呤3種主要代謝產(chǎn)物，其中茶堿具有類似咖啡因的興奮作用但相對較弱，可可堿和副黃嘌呤具有輕微的中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激作用，能促進(jìn)呼吸[4—5]?？Х纫虻拇x和排泄很大程度取決于肝藥酶和腎功能的發(fā)育程度[4，6]。由于早產(chǎn)兒體內(nèi)肝藥酶不足，腎功能尚未發(fā)育成熟，因此，咖啡因在早產(chǎn)兒體內(nèi)的血漿清除率極低，半衰期可達(dá)101 h，易產(chǎn)生蓄積，而引發(fā)煩躁不安、嘔吐、心動過速、腦和腸系膜血流速度降低等不良反應(yīng)，還可增加腦出血和壞死性小腸結(jié)膜炎的發(fā)生風(fēng)險[7—8]。

目前，關(guān)于咖啡因治療的最佳劑量和時機(jī)尚無標(biāo)準(zhǔn)方案，尤其是胎齡小于29 周的早產(chǎn)兒[7]。因此，咖啡因治療AOP時，更加需要注意藥物劑量和濃度監(jiān)測。有研究表明，在早產(chǎn)兒的血液和尿液中，咖啡因的血藥濃度和尿藥濃度具有相關(guān)性[9]，這提示可以通過檢測早產(chǎn)兒尿液中的咖啡因濃度來調(diào)整用藥劑量，以避免血樣采集對早產(chǎn)兒造成的創(chuàng)傷?；诖?，本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytandem mass，HPLC-MS/MS）技術(shù)測定了早產(chǎn)兒尿液中咖啡因及3種代謝產(chǎn)物（茶堿、可可堿、副黃嘌呤）的濃度并應(yīng)用于臨床，以分析早產(chǎn)兒體內(nèi)咖啡因代謝的特點，旨在為咖啡因最佳劑量的探尋提供方法學(xué)基礎(chǔ)，也為患兒的個體化治療和臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1290 Infinity型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、API 4000型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、BP 211D 型電子天平（德國Sartorius 公司）、PCB-11 型渦旋混合儀（德國Eppendorf公司）、Stratos型高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、Milli-Q Gradient 型純水儀[密理博（中國）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?-SYC-135-1，純度98%）、咖啡因-13C3-d3（內(nèi)標(biāo)，批號1-NAZ-37-1，純度98%）、可可堿對照品（批號1-PYL-44-1，純度98%）、茶堿對照品（批號ZZS-20-185-D6，純度100%）、副黃嘌呤對照品（批號2-AAH-100-1，純度99.14%）均購自加拿大Toronto Research Chemicals 公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；乙酸銨為分析純；水為純水。

1.3 空白尿液

健康成人尿液由本研究室提供，于-40 ℃冷凍保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

以Waters ACQUITY UPLC?BEH HILIC（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）為色譜柱，60 mmol/L乙酸銨溶液（A）-乙腈（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～4.2 min，1%A；4.2～4.5 min，1%A→45%A；4.5～6.0 min，45%A；6.0～6.2 min，45%A→1%A；6.2～7.5 min，1%A）；流速為0.5 mL/min；洗脫時間為7.5 min；柱溫為38 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，以多重反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行正離子掃描；離子源電壓為4 500 V；溫度為650 ℃；霧化氣壓為45 psi；渦輪氣壓為65 psi；氣簾氣壓為35 psi；碰撞氣壓為10 psi。用于定量分析的其他參數(shù)見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液及內(nèi)標(biāo)儲備液

精密稱取咖啡因?qū)φ掌?0.20 mg、茶堿對照品10.00 mg、副黃嘌呤對照品10.09 mg（均經(jīng)純度校正為10.00 mg），分別置于10 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容，得咖啡因、茶堿、副黃嘌呤質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL 的單一對照品儲備液。精密稱取可可堿對照品10.00 mg（經(jīng)純度校正為10.00 mg），置于10 mL 容量瓶中，加入二甲基亞砜溶解并定容，得可可堿質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL 的對照品儲備液。精密稱取內(nèi)標(biāo)10.00 mg（經(jīng)純度校正為10.00 mg），置于10 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。上述各儲備液均于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)控工作溶液

精密吸取“2.2.1”項下咖啡因、可可堿、茶堿和副黃嘌呤對照品儲備液，加入50%甲醇稀釋，得咖啡因質(zhì)量濃度為0.200、0.400、1.20、4.00、12.0、40.0、120、180、200 μg/mL，可可堿質(zhì)量濃度為0.100、0.200、0.600、2.00、6.00、20.0、60.0、90.0、100 μg/mL，茶堿、副黃嘌呤質(zhì)量濃度均為0.050、0.100、0.300、1.00、3.00、10.0、30.0、45.0、50.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液（以各成分質(zhì)量濃度最低值為定量下限）。同法制得咖啡因質(zhì)量濃度為0.500、6.00、10.0、160 μg/mL，可可堿質(zhì)量濃度為0.250、3.00、5.00、80.0 μg/mL，茶堿、副黃嘌呤質(zhì)量濃度均為0.125、1.50、2.50、40.0 μg/mL 的質(zhì)控工作溶液。上述各溶液均于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 內(nèi)標(biāo)工作溶液

精密吸取“2.2.1”項下內(nèi)標(biāo)儲備液50 μL，置于1.5 mL EP管中，精密加入乙腈950 μL，渦旋混勻，得質(zhì)量濃度為50.0 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液；精密吸取上述內(nèi)標(biāo)溶液，置于100 mL 容量瓶中，加入乙腈定容，得質(zhì)量濃度為50.0 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 尿液樣本預(yù)處理

精密吸取尿液樣本10 μL，置于1.5 mL EP 管中，加入“2.2.3”項下內(nèi)標(biāo)工作溶液150 μL，渦旋10 min；于4 ℃下，以16 000 r/min 離心15 min，取上清液20 μL，加入乙腈180 μL稀釋，渦旋混勻后，取上清液進(jìn)樣測定。

2.4 方法學(xué)考察

參照2020 年版《中國藥典》（四部）通則“9012”[10]對方法的專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、穩(wěn)定性進(jìn)行驗證。

2.4.1 專屬性考察

精密吸取6 個不同來源的空白尿液樣本10 μL，分別加入乙腈150 μL，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄空白尿液色譜圖（圖1A）。精密吸取“2.2.2”項下定量下限質(zhì)量濃度溶液5 μL，揮干，加入空白尿液10 μL，渦旋混勻，分別加入乙腈150 μL，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1B）。精密吸取“2.2.2”項下定量下限質(zhì)量濃度溶液5 μL，揮干，加入患兒給藥0～4 h 后的尿液樣本10 μL，渦旋混勻，分別加入乙腈150 μL，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1C）。結(jié)果表明，尿液樣本中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾各成分和內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1 咖啡因及代謝產(chǎn)物的典型色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取“2.2.2”項下系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液5 μL，揮干，加入空白尿液10 μL，渦旋混勻，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定。以各待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、各待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），采用加權(quán)最小二乘法（加權(quán)因子為1/X2）進(jìn)行線性擬合。結(jié)果見表2。

表2 咖啡因及代謝產(chǎn)物的回歸方程與線性范圍

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗

取“2.2.2”項下定量下限質(zhì)量濃度溶液和質(zhì)控工作溶液，各質(zhì)量濃度平行5份，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。將實測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，以相對誤差（relative error，RE）考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間精密度的RSD 均不高于10.37%，RE為-5.00%～12.00%。結(jié)果見表3。

表3 咖啡因及代謝產(chǎn)物的精密度與準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取6 個不同來源的空白尿液樣本，加入“2.2.2”項下質(zhì)控工作溶液，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積（A1）；取6個不同來源的空白尿液樣本，加入乙腈沉淀后，再加入“2.2.2”項下質(zhì)控工作液及內(nèi)標(biāo)溶液（取內(nèi)標(biāo)儲備液，加入50%甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度為3 μg/mL），按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積（A2）；取EP管數(shù)支，加入“2.2.2”項下質(zhì)控工作溶液，再加入初始比例的流動相溶液，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積（A3）。基質(zhì)因子＝A2/A3×100%，提取回收率＝A1/A2×100%。結(jié)果顯示，咖啡因及3 種代謝產(chǎn)物的基質(zhì)因子為85.68%～109.90%，提取回收率為93.53%～109.40%，RSD均小于15%。

2.4.5 穩(wěn)定性考察

按“2.2.2”項下方法分別制備低、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣本溶液（咖啡因質(zhì)量濃度分別為0.500、160 μg/mL，可可堿分別為0.250、80.0 μg/mL，茶堿和副黃嘌呤均分別為0.125、40.0 μg/mL），各質(zhì)量濃度平行3 份，分別于室溫下放置10 h、進(jìn)樣器放置20 h、長期凍存（-40、-80 ℃凍存45 d）和反復(fù)凍融3次（-40、-80 ℃）后，按“2.3”項下方法預(yù)處理，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，考察上述不同條件下各樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各樣品在上述不同條件下的穩(wěn)定性良好，RSD均小于15%。

2.5 臨床應(yīng)用

2.5.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）胎齡＜34 周；（2）伴有呼吸暫停，呼吸暫停時間＞20 s，或伴有心率下降（心率＜100次/min）或經(jīng)皮血氧飽和度＜80%。

本研究的排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）體溫＞38.5 ℃或＜36.0 ℃；（2）臨床懷疑或證實的敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；（3）臨床證實的缺氧缺血性腦病、癲癇；（4）臨床懷疑或確診的壞死性小腸結(jié)腸炎；（5）紅細(xì)胞壓積＞65%或＜40%；（6）血尿素氮＞20 mg/dL或尿量＜1 mL/（kg·h）；（7）心臟超聲證實動脈導(dǎo)管未閉并伴有血流動力學(xué)顯著異常；（8）嚴(yán)重的先天性心臟病，如大動脈轉(zhuǎn)位、左室發(fā)育不良綜合征等；（9）顱內(nèi)出血Ⅲ、Ⅳ級；（10）單純阻塞性呼吸暫停，如頸部過度屈曲、氣道分泌物過多等；（11）確診的先天性氣道發(fā)育畸形、先天性中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常等；（12）母親有精神疾病或長期口服精神類藥物；（13）母親妊娠期使用嗎啡類藥物或藥物成癮者；（14）父母系近親結(jié)婚或患兒有先天性遺傳代謝性疾病等。

2.5.2 資料來源

收集2021 年11 月-2022 年3 月江蘇省婦幼保健院收治的19 例AOP 患兒，其中男性9 例，女性10 例，胎齡（27.7±1.7）周，出生體重（1.08±0.34）kg。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，倫理號為2021-SR-547。所有患兒監(jiān)護(hù)人均簽署了知情同意書。

2.5.3 用藥情況、檢測方法及檢測結(jié)果

所有患兒均給予枸櫞酸咖啡因注射液[意大利Alfasigma S.p.A.，國藥準(zhǔn)字HJ20181129，規(guī)格1 mL∶20 mg（相當(dāng)于咖啡因10 mg）]。給藥劑量為：以20 mg/kg（以藥品中咖啡因含量計算，下同）為負(fù)荷劑量，靜脈輸注30 min后，間隔24 h，以10 mg/kg為維持劑量，每24 h緩慢靜脈輸注15 min。待枸櫞酸咖啡因注射液靜脈滴注0～4 h后，取患兒尿液樣本，按“2.3”項下方法預(yù)處理后，再按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，患兒尿液中咖啡因、茶堿、副黃嘌呤、可可堿的質(zhì)量濃度分別為（27.346±7.951）、（0.351±0.223）、（0.428±0.395）、（0.472±0.374）μg/mL。

3 討論

血藥濃度監(jiān)測是臨床常用的監(jiān)測手段，但由于早產(chǎn)兒的血量較少，血管較細(xì)，血液樣本采集較難，故臨床上較難進(jìn)行常規(guī)血藥濃度監(jiān)測?！秲嚎迫巳核幬锱R床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》指出，應(yīng)盡量減少早產(chǎn)兒的抽血量和/或靜脈穿刺次數(shù)，以避免對早產(chǎn)兒造成不必要的損傷[11]。相較于血液樣本，早產(chǎn)兒尿液樣本的收集方式為非侵入性，可最大限度地減少早產(chǎn)兒侵入性血液采集的次數(shù)，同時還能實時監(jiān)測早產(chǎn)兒體內(nèi)咖啡因及代謝產(chǎn)物的濃度?？Х纫蛑饕?jīng)肝臟代謝，約有84%轉(zhuǎn)化為副黃嘌呤，12%轉(zhuǎn)化為茶堿，4%轉(zhuǎn)化為可可堿[12]。由于不同個體對咖啡因的代謝能力存在差異[8，12]，因此，同時測定咖啡因及代謝產(chǎn)物的濃度能準(zhǔn)確地了解咖啡因在不同個體內(nèi)的代謝情況，可為個體化用藥提供依據(jù)。

本研究建立了同時檢測AOP 患兒尿液中咖啡因及3種代謝產(chǎn)物濃度的方法，一次性完成多個組分的測定，可提高測定效率和藥物檢測時效。AOP 患兒靜脈給予枸櫞酸咖啡因后，通常在給藥后0.5～2 h 達(dá)到藥物濃度峰值，血藥濃度有效范圍為10～20 mg/L，但此范圍尚不是金標(biāo)準(zhǔn)，仍在不斷完善中[13]。Cattarossi等[9]研究表明，胎齡29～34 周早產(chǎn)兒使用咖啡因治療24 h 內(nèi)的血藥濃度和尿藥濃度具有相關(guān)性，且二者比值接近1，提示檢測尿藥濃度可以作為評估咖啡因治療范圍的有效手段。本研究顯示，AOP 患兒尿液中咖啡因的質(zhì)量濃度為（27.346±7.951）μg/mL，治療效果較好，且未出現(xiàn)不良反應(yīng)，這表明在該質(zhì)量濃度下，咖啡因安全有效。但由于樣本較少，結(jié)果存在一定局限性，仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步證實。

HILIC 色譜柱的流動相通常含有濃度較高的乙腈，具有黏度低、系統(tǒng)背壓小、檢測靈敏度高等優(yōu)點[14]。本課題組前期考察了水相60 mmol/L乙酸銨溶液和有機(jī)相乙腈的不同比例，當(dāng)水相與有機(jī)相的初始比例為1∶99時，咖啡因及3種代謝產(chǎn)物的分離效果達(dá)到最佳，且具有合適的保留時間。此外，本研究的樣品前處理采用乙腈沉淀蛋白法，該方法操作簡單、快捷，樣本前處理所需的尿液樣本用量較少。

綜上所述，本研究所建HPLC-MS/MS 法操作簡單、靈敏度高，可用于AOP患兒尿液中咖啡因及3種代謝產(chǎn)物濃度的測定。