陳紅巖 陳英 陳梅根 李華

肺癌目前仍然是發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤, 隨著肺癌發(fā)生逐年增加, 肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者近年呈現(xiàn)明顯增高趨勢(shì)［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［2］約有15%肺癌患者會(huì)出現(xiàn)腦膜轉(zhuǎn)移。腦膜轉(zhuǎn)移癌又稱為腦膜癌病變,多是由于原發(fā)癌灶中的腫瘤細(xì)胞在腦膜、脊髓蛛網(wǎng)膜下間隙局灶性浸潤(rùn)或彌漫性擴(kuò)散而致病。有數(shù)據(jù)顯示［3,4］, 肺癌繼發(fā)腦膜轉(zhuǎn)移患者若不接受治療, 其中位生存時(shí)間只有4～6 周, 若接受綜合治療生存期可能會(huì)延遲到3～5 個(gè)月, 最長(zhǎng)達(dá)3 年以上。早診斷、早干預(yù)對(duì)本病預(yù)后改善有積極的作用。在臨床上診斷腦膜轉(zhuǎn)移的方法主要有磁共振成像(MRI)增強(qiáng)掃描、腦脊液細(xì)胞學(xué)檢測(cè), 其中腦脊液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［5］。近年有研究報(bào)道顯示［6］, 造成肺癌腦膜轉(zhuǎn)移的因素較多, 如機(jī)體的免疫功能、血腦屏障損傷等,其中與腫瘤細(xì)胞整合素活性度有極大的關(guān)系。整合素β1是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的重要分子, 可影響腫瘤細(xì)胞增殖分化與遷移、侵襲［7］。目前已有研究指出［8］, 整合素β1可促使腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中粘附、遷移、侵襲, 但其在肺癌腦膜轉(zhuǎn)移中的表達(dá)及其診斷價(jià)值相關(guān)研究較少見。為深入探討肺癌腦膜轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞整合素β1活性程度及其臨床應(yīng)用價(jià)值, 現(xiàn)將近2 年來肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者30 例與腦部非腫瘤疾病患者30 例進(jìn)行腰穿腦脊液癌細(xì)胞整合素β1活性程度檢測(cè), 結(jié)果分析報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月～2022 年12 月福建省市三級(jí)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、外科、腫瘤科、呼吸內(nèi)科及重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)等臨床確診為“肺癌”且經(jīng)多周期化療、放療及綜合治療的住院患者并經(jīng)腦脊液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)確診為肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者30 例設(shè)為病例組, 其中男14 例, 女16 例；年齡35～84 歲, 平均年齡(56.17±13.62)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①顱腦MRI 掃描顯示轉(zhuǎn)移癌灶；②近6 個(gè)月內(nèi)無顱腦損傷病史或腦炎病史, 且無顱腦手術(shù)史；③經(jīng)脫水等治療后顱內(nèi)高壓癥狀改善, 但改善不明顯；④無腦脊髓膜疾病。確診方法：11 例經(jīng)肺癌根治術(shù)后病理組織檢查確診, 19 例經(jīng)微創(chuàng)穿刺活檢病理檢查確診；基因檢測(cè)：除3 例未檢出基因突變點(diǎn), 其余27 例均發(fā)現(xiàn)基因突變點(diǎn), 突變點(diǎn)多為表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)21 外顯子L858R 突變, 其中3 例在EGFR 19 突變, 2 例P53 突變；從原發(fā)腫瘤發(fā)現(xiàn)到腦膜轉(zhuǎn)移時(shí)間2 個(gè)月～5 年, 平均時(shí)間(11.02±2.33)個(gè)月。另選取同期30 例腦部非腫瘤性疾病患者設(shè)為對(duì)照組, 其中男15 例, 女15 例；年齡30～80 歲, 平均年齡(55.36±13.10)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為交通性腦積水；②住院治療期間需要經(jīng)腰椎穿刺、腦室外引流、腰大池引流等收集腦脊液樣本行腦脊液檢查。兩組性別、年齡等一般資料對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法 腫瘤細(xì)胞整合素β1免疫組化染色 ：采用細(xì)胞玻片離心法收集兩組患者的腦脊液腫瘤細(xì)胞, 加腦脊液量2.5 ml, 若為腦室引流液量較多時(shí), 先用物理方法濃縮10 倍, 再進(jìn)行細(xì)胞收集, 標(biāo)本應(yīng)為當(dāng)天的引流液。細(xì)胞收集后玻片置37℃溫箱60 min, 并采用免疫組化PV 系列二步法, DAB 顯色。試劑：①整合素β1抗體(Anti-Integrin beta 1 抗體)由英國(guó)ABCAM 公司提供；②DAB 顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；③通用型二步法試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司分公司。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) ①分析病例組腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1表達(dá)情況。②比較兩組腦脊液的腫瘤細(xì)胞整合素β1陽性表達(dá)情況, 腫瘤細(xì)胞整合素β1陽性判定：整合素β1免疫組化染色DAB 顯色后為棕黃色帶或棕黃色顆粒, 分布于腫瘤細(xì)胞膜及細(xì)胞漿。隨機(jī)計(jì)數(shù)100 個(gè)腫瘤細(xì)胞, 根據(jù)著色度和數(shù)量判斷陽性細(xì)胞所占百分比。陽性程度分級(jí)：陰性(-)：陽性細(xì)胞≤4%；陽性(+)：陽性細(xì)胞5%～10%；陽性(++)：陽性細(xì)胞11%～50%；陽性(+++)：陽性細(xì)胞≥50%。陽性細(xì)胞所占比例≤10%為活性低表達(dá), 陽性細(xì)胞≥11%為活性高表達(dá)［9,10］。③分析腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1活性高表達(dá)對(duì)肺癌腦膜轉(zhuǎn)移的診斷效能, 包括靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1表達(dá)情況分析肺癌腦膜轉(zhuǎn)移腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1活性主要呈高表達(dá), 在胞膜及胞漿呈現(xiàn)明顯的棕黃色帶或棕黃色顆粒。見圖1, 圖2。其他細(xì)胞如激活型單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等則不顯色或顏色很淡。見圖3, 圖4。

圖1 腫瘤細(xì)胞膜整合素β1 表達(dá)陽性(免疫組化染色×1000)

圖2 腫瘤細(xì)胞漿整合素β1 表達(dá)陽性(免疫組化染色×1000)

圖3 激活型單核細(xì)胞整合素β1 表達(dá)陽性(免疫組化染色×1000)

圖4 淋巴細(xì)胞整合素β1 表達(dá)陽性(免疫組化染色×1000)

2.2 兩組腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1表達(dá)情況比較病例組整合素β1活性高表達(dá)率為80.00%, 顯著高于對(duì)照組的3.33%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1 表達(dá)情況比較［n(%)］

2.3 腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1高表達(dá)對(duì)肺癌腦膜轉(zhuǎn)移的診斷效能分析 腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1活性高表達(dá)診斷肺癌腦膜轉(zhuǎn)移的靈敏度為80.00%(24/30),特異度為96.67%(29/30), 準(zhǔn)確率為88.33%(53/60), 陽性預(yù)測(cè)值為96.00%(24/25), 陰性預(yù)測(cè)值為82.86%(29/35)。

3 討論

肺癌腦膜轉(zhuǎn)移病情進(jìn)展較迅速, 患者預(yù)后極差,早期診療能夠延緩病情進(jìn)展, 在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存期。當(dāng)前臨床診斷肺癌腦膜轉(zhuǎn)移標(biāo)準(zhǔn)［11］：①有肺癌病史；②新出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)癥狀體征；③顱腦MRI 顯示顱腦內(nèi)癌灶征象；④腦脊液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示存在循環(huán)肺癌惡性腫瘤細(xì)胞。在符合①、②的基礎(chǔ)上具有③和④中任一項(xiàng)即確診。但在臨床實(shí)際中90%以上腦膜轉(zhuǎn)移患者的神經(jīng)癥狀體征不明顯, 顱腦MRI 診斷特異度雖可達(dá)到100%, 但其假陰性率較高,可達(dá)到65%［12］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［13］腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞首次檢測(cè)陽性率只有55%, 二次檢測(cè)陽性率可升高至80%, ≥3 次檢測(cè)并不會(huì)增加陽性率, 可見上述目前各種檢測(cè)手段均存有優(yōu)缺點(diǎn), 仍需探索靈敏度、特異度更為良好的肺癌腦膜轉(zhuǎn)移診斷方法。癌癥最基本、最重要的病理特點(diǎn)是癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移［14］。在臨床上,腫瘤復(fù)發(fā)或癌灶轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因。國(guó)內(nèi)外研究表明［15,16］, 腫瘤侵襲及其遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移是多因素共同參與的過程, 其中細(xì)胞粘附是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 而細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞粘附因子在其中起著重要的作用。整合素家族、鈣粘素家族、免疫球蛋白家族、選擇素家族等均是目前最常見的可參與細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間粘附效應(yīng)的細(xì)胞表面粘附分子, 其中整合素在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的作用備受關(guān)注。

3.1 整合素活性程度升高參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程整合素作為細(xì)胞表面粘附分子家族中的重要一員, 屬于跨膜受體蛋白的一種, 其廣泛存在于細(xì)胞表面, 通常由一個(gè)α 鍵和β 鍵非共價(jià)聯(lián)接形成跨膜異二聚體糖蛋白, 配體多是多種細(xì)胞外基質(zhì)成分。整合素的生理功能主要通過與配體細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合, 介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附, 促使腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)外雙向信號(hào)傳導(dǎo), 誘發(fā)癌細(xì)胞增殖分化、遷移侵襲等病理活動(dòng)［17］。據(jù)臨床研究表明［18,19］, 當(dāng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán), 整合素活性度明顯增高, 這有利于瘤細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮, 使癌細(xì)胞隨血流轉(zhuǎn)移。

截至當(dāng)前, 學(xué)者在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了18 種α亞型和8 種β 亞型整合素［20］, 大量研究發(fā)現(xiàn), 整合素β1在多種癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用, 如肺癌［21］、乳腺癌［22］、胃癌［23］等。魏哲威等［24］研究顯示, 胃癌細(xì)胞中整合素β1呈高表達(dá), 并參與胃癌細(xì)胞遷移。整合素β1與其相應(yīng)配體結(jié)合后可促使粘著斑激酶激活,形成粘著斑, 并可促使腫瘤新生血管形成, 促使癌細(xì)胞向周圍正常組織侵襲, 進(jìn)而參與腫瘤遷移、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移瘤形成。本研究證實(shí), 肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者整合素β1活性度較腦部非腫瘤患者明顯增高, 且肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中80%癌細(xì)胞整合素β1活性度為(++)與(+++), 提示肺癌細(xì)胞從原發(fā)癌灶中脫落粘附于鄰近組織臟器, 進(jìn)而對(duì)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。臨床上肺癌一旦出現(xiàn)腦膜轉(zhuǎn)移, 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)明顯的陽性體征, 如頭痛、惡心、嘔吐或認(rèn)知功能障礙等。腦脊液檢查也會(huì)出現(xiàn)明顯異常, 如葡萄糖降低、總蛋白質(zhì)增高、腫瘤細(xì)胞明顯增多等。細(xì)胞學(xué)分析瘤細(xì)胞胞體巨大, 是小淋巴細(xì)胞5～10 倍以上, 核分裂相增多、核染色質(zhì)粗、核內(nèi)有明顯的核仁、胞漿嗜堿性, 并含有空泡［25］, 這些都與癌細(xì)胞整合素活性程度高有明顯相關(guān)性。

3.2 腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1活性檢測(cè)診斷肺癌腦膜轉(zhuǎn)移臨床效能較高 本研究采用細(xì)胞玻片離心法收集腰穿腦脊液中的腫瘤細(xì)胞, 由于第二代細(xì)胞玻片離心儀［26］收集管容量大且密封性能好, 離心后細(xì)胞流失極少, 極大提高腦脊液中腫瘤細(xì)胞收集效果。經(jīng)免疫組化染色后, 根據(jù)陽性分級(jí)程度［27,28］, 本組陽性細(xì)胞平均為43.2%, 最高為84%, 且本研究還發(fā)現(xiàn)腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1活性高表達(dá)診斷肺癌腦膜轉(zhuǎn)移的靈敏度為80.00%, 特異度為96.67%, 準(zhǔn)確率為88.33%, 陽性預(yù)測(cè)值為96.00%, 陰性預(yù)測(cè)值為82.86%, 提示腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1活性檢測(cè)診斷特異度高, 這可能是腦脊液中癌細(xì)胞數(shù)量多, 也明顯提高腫瘤細(xì)胞收集與組化染色效果, 但其靈敏度相對(duì)稍低, 30 例患者中仍有3 例腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1表達(dá)為陰性, 這可能是由于腦膜轉(zhuǎn)移處于發(fā)展初期, 癌細(xì)胞數(shù)量較少, 故其陽性細(xì)胞低于4%, 整合素呈低活性度。

癌性腦膜炎癌細(xì)胞整合素β1活性度增高, 有利于癌細(xì)胞的侵襲、生長(zhǎng), 同時(shí)也加劇病情的惡化, 特別在病情進(jìn)展時(shí), 化療、靶藥仍無法控制癌細(xì)胞擴(kuò)散情況下, 通過應(yīng)用整合素靶向藥物調(diào)控整合素的活性程度將有效控制病情發(fā)展［26-29］。時(shí)刻監(jiān)測(cè)腦脊液腫瘤細(xì)胞整合素β1活性對(duì)肺癌腦膜轉(zhuǎn)移病情的發(fā)展或復(fù)發(fā)起重要作用。

綜上所述, 肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中腫瘤細(xì)胞整合素β1活性度明顯增高, 故檢測(cè)腦脊液中腫瘤細(xì)胞整合素β1活性度有助于提高本病鑒別診斷能力。