張 濤，田盈盈，趙鴻彬

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于真核生物的基因組中，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答等方面有著較為重要的調(diào)控功能[1]。燕麥（Avena sativa L.）是世界七大栽培作物之一，起源于地中海沿岸，分布于世界五大洲，集中種植在高緯度地區(qū)[2]。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)燕麥bZIP基因家族的理化性質(zhì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究，為探究燕麥bZIP基因的功能和分子機(jī)制提供了依據(jù)，為燕麥分子育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 基因家族成員的篩選

燕麥基因組從GrainGens網(wǎng)站下載，擬南芥、大麥、節(jié)節(jié)麥、水稻、玉米、粗山羊草和小麥基因組從Ensembl網(wǎng)站下載。bZIP結(jié)構(gòu)域HMM文件下載于Pfam網(wǎng)站。通過HMMER3.3.2從燕麥基因組中獲取bZIP家族成員，使用NCBI的Batch CD-Search進(jìn)行篩選[3]。

1.2 蛋白質(zhì)性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用網(wǎng)站ExPASy預(yù)測(cè)燕麥bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的理化性質(zhì)。通過Cello網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位[3]。

1.3 AsbZIP蛋白結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

用NCBI的Batch CD-Search檢索AsbZIP上的所有結(jié)構(gòu)域[3]。根據(jù)燕麥基因組注釋文件分析AsbZIP基因結(jié)構(gòu)、外顯子和內(nèi)含子數(shù)量[4]。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將燕麥和擬南芥bZIP氨基酸序列導(dǎo)入MEGA-X軟件中，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用Evoview進(jìn)行美化[3]。

1.5 燕麥與其他物種基因組的共線性分析

使用Tbtools軟件檢測(cè)AsbZIP基因在燕麥基因組的共線區(qū)域，以及AsbZIP基因與擬南芥、大麥、節(jié)節(jié)麥、水稻、玉米、粗山羊草和小麥基因組的共線區(qū)塊，可視化燕麥與上述物種之間的共線性性關(guān)系[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AsbZIP基因家族鑒定

使用HMMER3.3.2和NCBI的Batch CD-Search數(shù)據(jù)庫檢測(cè)，共獲得387條包含bZIP結(jié)構(gòu)域的蛋白，將它們依次命名為AsbZIP001～AsbZIP387。

2.2 燕麥bZIP基因在染色體上的分布

AsbZIP基因在A，C，D染色體上的分布比例分別為35.13%，33.85%，31.03%。根據(jù)燕麥bZIP基因在染色體上的分布可以發(fā)現(xiàn)（圖1），AsChrUn上不存在任何AsbZIP基因。除燕麥bZIP_C亞家族外，燕麥AsbZIP基因的bZIP_1、2、Maf亞家族基因分布在其余21條染色體上，且分布在AsChr5A上的基因最多。AsbZIP_1有137個(gè)基因；AsbZIP_2有132個(gè)基因；AsbZIP_Maf有106個(gè)基因；AsbZIP_C有10個(gè)基因。

圖1 燕麥AsbZIP基因位置圖

2.3 AsbZIP成員的性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

利用E x P A S y 網(wǎng)站預(yù)測(cè)燕麥b Z I P 轉(zhuǎn)錄因子家族成員性質(zhì)。在AsbZIP家族中，蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度在76～1255aa，平均長(zhǎng)度為402.124aa。分子量在8864.06～138121.7Da，平均分子量為43689.54Da。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（pI）在4.6～10.24，平均值為7.26。

根據(jù)CELLO的預(yù)測(cè)，燕麥AsbZIP的成員分別有69個(gè)表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)、28個(gè)定位在細(xì)胞外、60個(gè)定位在膜外、177個(gè)定位在細(xì)胞周質(zhì)上。

2.4 AsbZIP基因家族的結(jié)構(gòu)域與基因結(jié)構(gòu)分析

比較結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，AsbZIP家族成員擁有10種bZIP結(jié)構(gòu)域，有bZIP_plant_BZIP46、bZIP_HY5-like、bZIP_1、bZIP_C、bZIP_plant_GBF1、bZIP_2、bZIP_plant_RF2、bZIP_HBP1b-like、bZIP和bZIP superfamily。大部分燕麥bZIP成員都有著不止一個(gè)結(jié)構(gòu)域，bZIP_1、bZIP_2和bZIP_Maf家族成員的bZIP結(jié)構(gòu)域還可以與其他非bZIP結(jié)構(gòu)域發(fā)生重疊。四個(gè)bZIP家族中，部分bZIP成員含有兩個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)域。

基因結(jié)構(gòu)顯示，在AsbZIP_1中，外顯子數(shù)目為3～20個(gè)；在AsbZIP_2中，外顯子數(shù)目為3～17個(gè)；在AsbZIP_C中，外顯子數(shù)目為8個(gè)；在AsbZIP_Maf中，外顯子數(shù)目為3～17個(gè)。

2.5 AsbZIP基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為研究燕麥bZIP蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，基于擬南芥和燕麥共465個(gè)bZIP成員的蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。最終根據(jù)擬南芥分類系統(tǒng)將燕麥和擬南芥的bZIP基因分為15組。其中L組的成員是多的，共有104個(gè)AsbZIP成員。其中在G、H、K和N組中僅有燕麥的bZIP的蛋白，不含擬南芥基因。

圖2 燕麥和擬南芥bZIP基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 燕麥與其他物種基因組共線性分析

為了進(jìn)一步分析燕麥與其他物種的親緣關(guān)系，我們構(gòu)建了燕麥和擬南芥、大麥、二穗短柄草、水稻、節(jié)節(jié)麥、玉米和小麥的基因組共線性分析圖（圖3）。根據(jù)各分析結(jié)果推測(cè)，燕麥與小麥基因組的染色體共線性比燕麥與其他物種更高，即燕麥與小麥在進(jìn)化關(guān)系上更近，而與其他物種較遠(yuǎn)。

圖3 AsbZIP基因組共線性分析

3 討論

文章通過對(duì)387個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子燕麥進(jìn)行染色體定位、理化性質(zhì)分析、與擬南芥bZIP成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹及其他物種進(jìn)行共線性分析。在AsbZIP家族中，蛋白質(zhì)序列平均長(zhǎng)度為402.124aa，平均分子重量為43689.54Da，平均等電點(diǎn)為7.26。AsbZIP表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外、膜外和細(xì)胞周質(zhì)上。在AsbZIP轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)10種不同的bZIP結(jié)構(gòu)域，且一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能同時(shí)含有不止一個(gè)bZIP結(jié)構(gòu)域，說明該基因家族功能的多樣性。

大部分AsbZIP成員與AtbZIP成員有較高同源性，但在G、H、K和N組中僅有AsbZIP，不含AtbZIP蛋白。通過基因組共線性結(jié)果發(fā)現(xiàn)燕麥與小麥基因組的染色體共線性比燕麥與其他物種更高，即燕麥與小麥在進(jìn)化關(guān)系上更近。鑒于bZIP轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的重要調(diào)控作用，該實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步加深對(duì)燕麥AsbZIP轉(zhuǎn)錄因子的研究，為驗(yàn)證AsbZIP基因功能提供依據(jù)。