陳宏宇 于 瑩

（1貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f）為蘭科石斛屬多年生草本植物，生長(zhǎng)于海拔1 100～1 700 m 地區(qū)，在我國(guó)主要分布于云南等地[1-2]。翅萼石斛的花具有較高的觀賞價(jià)值，市場(chǎng)上翅萼石斛主要以野外采挖為主，導(dǎo)致野生資源數(shù)量銳減。

極端溫度是常見(jiàn)的非生物脅迫，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有著重要影響。低溫可引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，造成電解質(zhì)外滲，氧化代謝平衡失調(diào)，活性氧積累，脂類過(guò)氧化[3]。低溫引起信號(hào)分子響應(yīng)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控一系列復(fù)雜的傳導(dǎo)過(guò)程，促使特定抗逆功能基因表達(dá)。功能基因可提高細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化能力和保護(hù)酶數(shù)量等，使植物產(chǎn)生耐受能力[4]。DREB/CBF（C-repeat binding factor）是AP2/乙烯應(yīng)答因子DNA結(jié)合蛋白，是最早發(fā)現(xiàn)的低溫調(diào)控基因[5]。擬南芥中過(guò)表達(dá)CBF基因能提高低溫耐受特性[6]。類似的還有MAPK、鈣調(diào)蛋白、CDPK 和ICE轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)基因[7]。

氣候變暖導(dǎo)致高溫極端天氣增多，對(duì)植物產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的傷害。高溫脅迫會(huì)改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和組分變化，內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊并產(chǎn)生毒蛋白，葉綠體和線粒體功能失常[8]。與低溫類似的，高溫也是通過(guò)信號(hào)分子調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，再啟動(dòng)抗逆功能基因表達(dá)。功能基因通過(guò)細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、核酸和代謝等方面的保護(hù)作用，使植株產(chǎn)生耐受能力[9]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TT1、TT2、EF-Tu、GCN5等抗逆基因的分子機(jī)制[10]。

高通量測(cè)序技術(shù)用于大規(guī)模分析基因表達(dá)并識(shí)別基因調(diào)控通路[11]。Fowler 等[12]利用基因芯片方法研究了植物低溫應(yīng)答機(jī)制，識(shí)別了306 個(gè)低溫應(yīng)答關(guān)鍵基因，類似的還有馬鈴薯[13]、番茄[14]等。Zhao等[15]利用測(cè)序技術(shù)，在高山離子芥測(cè)序數(shù)據(jù)中組裝54 870 個(gè)基因，并識(shí)別了數(shù)千個(gè)低溫調(diào)控基因。隨后，有關(guān)植物低溫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)展迅速，小麥、水稻、香蕉、菠蘿、鐵皮石斛等，促進(jìn)了低溫應(yīng)答機(jī)制的研究進(jìn)展[16]。與低溫類似的，高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組也是植物學(xué)研究熱點(diǎn)。Li 等[17]利用轉(zhuǎn)錄組，研究了柳枝稷高溫脅迫分子機(jī)制，識(shí)別了5 365個(gè)差異表達(dá)基因。王曉曼等[18]報(bào)道了棉花、苦瓜、茶樹(shù)、牡丹、滸苔、草莓、水稻等亞麻植物相關(guān)的高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組研究。

為了研究翅萼石斛花在極端溫度脅迫下的基因表達(dá)差異和調(diào)控通路，本試驗(yàn)對(duì)翅萼石斛花開(kāi)展低溫和高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并比較分析，識(shí)別翅萼石斛花溫度脅迫應(yīng)答基因，分析調(diào)控通路，為進(jìn)一步研究翅萼石斛花溫度響應(yīng)分子機(jī)制提供基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料預(yù)處理

翅萼石斛由本試驗(yàn)室提供并鑒定，栽培基質(zhì)為碎松樹(shù)皮+木屑（3∶1），人工氣候室（22 ℃，14 h 光照/d）。處理時(shí)將開(kāi)花的翅萼石斛移入4 ℃和40 ℃進(jìn)行低溫、高溫脅迫處理，3 h 后取花。以未脅迫作為對(duì)照，稱取相同重量，混樣后經(jīng)液氮冷凍提取總RNA。

1.2 RNA提取與測(cè)序

利用RNA 提取試劑盒（Invitrogen）提取樣本總RNA，通過(guò)RQ1 DNA 酶（Promega）進(jìn)行DNA 消化。純化后的mRNAs 在95 ℃裂解后修復(fù)末端，連接5'接頭，利用隨機(jī)六聚體和帶3'接頭的RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。純化cDNA 被擴(kuò)增產(chǎn)生150～200 bp 的PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行定量和純化。利用Illumina IIx 基因組分析系統(tǒng)進(jìn)行32 nt 單端轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)后，以FASTQ格式文件保存。

1.3 基因組裝與注釋

利用軟件Cutadapt（v1.9.1）去除接頭序列、去除5'或3'末端質(zhì)量值低于20 或含N 堿基，去除trim 后reads 長(zhǎng)度低于75 bp 的序列。合并所有樣本數(shù)據(jù)后，利用軟件Trinity（v2.2.0）進(jìn)行從頭組裝，序列聚類后進(jìn)行序列拼接和冗余去除，得到非冗余長(zhǎng)Unigene 序列，統(tǒng)計(jì)序列數(shù)量與長(zhǎng)度分布。利用軟件Trans Decoder（v3.0.0）鑒定ORF 序列，以最長(zhǎng)的500 個(gè)ORF 序列為訓(xùn)練集，利用Markov 模型預(yù)測(cè)。利用BLAST 軟件對(duì)Unigene 進(jìn)行Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)、SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)、GO 數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)和COG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。

1.4 基因表達(dá)與調(diào)控通路分析

利用FPKM（Fragment Per Kilo Bases per Million Reads）值表示對(duì)應(yīng)Unigene的表達(dá)量。使用Bioconductor 軟件包的edgeR（v3.4.6）進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異基因表達(dá)變化2 倍以上且qvalue≤0.05 定義為差異顯著基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序與注釋

對(duì)翅萼石斛花3 個(gè)樣本測(cè)序，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，分別獲得37 422 984、27 744 744和28 053 906個(gè)Reads（讀長(zhǎng)）數(shù)據(jù)，所有樣本Q20 檢測(cè)值均大于97.54%，Q30檢測(cè)值均大于93.20%。從頭組裝后，在3 個(gè)組織共獲得220 941 條長(zhǎng)的、非冗余單基因（Unigene），長(zhǎng)度分布在201～16 589 bp，平均長(zhǎng)度620.33 bp，GC 含量為40.10%。利用Nr、COG、SwissProt 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋了91 380、31 193、45 362和8 462條單基因，共94 784條單基因。

2.2 差異表達(dá)基因分析

不同溫度對(duì)翅萼石斛花誘導(dǎo)基因表達(dá)的數(shù)量不同。經(jīng)過(guò)計(jì)算，與對(duì)照相比，翅萼石斛花識(shí)別了低溫誘導(dǎo)表達(dá)基因451 個(gè)，低溫抑制表達(dá)基因856 個(gè)；高溫誘導(dǎo)表達(dá)基因5 411 個(gè)，高溫抑制表達(dá)基因5 020 個(gè)。表明翅萼石斛花在受到極端溫度后均發(fā)生了較大程度的基因表達(dá)變化，低溫脅迫下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量多于上調(diào)表達(dá)基因，高溫脅迫差異表達(dá)基因數(shù)量多于低溫脅迫差異表達(dá)基因。

2.3 基因調(diào)控通路分析

利用GO 聚類分析對(duì)顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類，研究具有相同代謝過(guò)程或細(xì)胞途徑的基因類群。結(jié)果表明，翅萼石斛花的低溫應(yīng)答基因有30個(gè)顯著富集功能聚類，分為3 大類：生物過(guò)程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function），分別有13、6 和11 個(gè)功能聚類。相應(yīng)的，翅萼石斛花的高溫應(yīng)答基因，分別有11、12 和7 個(gè)功能聚類。表1 和表2 分別列出了排名前5 位的類別。由表1、表2 可知，翅萼石斛花在極端溫度脅迫下有大量基因表達(dá)，過(guò)程涉及膜組成部分、高溫脅迫應(yīng)答、ATP 結(jié)合等多個(gè)過(guò)程，說(shuō)明這些生物學(xué)過(guò)程對(duì)于翅萼石斛花溫度應(yīng)答非常重要。

表1 翅萼石斛花低溫脅迫應(yīng)答基因的GO聚類分析

表2 翅萼石斛花高溫脅迫應(yīng)答基因的GO聚類分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析，推測(cè)參與生化代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的相互協(xié)調(diào)特征。結(jié)果表明，翅萼石斛花的低溫應(yīng)答基因歸屬通路分為5大類：細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息過(guò)程、遺傳信息過(guò)程、代謝和生物系統(tǒng)分別有1、2、4、22和1個(gè)通路（表3）。相應(yīng)的，翅萼石斛花的高溫應(yīng)答基因歸屬通路分為4大類：細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息過(guò)程、遺傳信息過(guò)程和代謝分別有1、1、7和16個(gè)通路。

表3 翅萼石斛花低溫脅迫差異表達(dá)基因的KEGG分析

KEGG 富集分析結(jié)果表明，代謝過(guò)程是最主要的富集途徑。在低溫誘導(dǎo)下，代謝和次生代謝途徑包含了很多基因。在高溫誘導(dǎo)下，基因數(shù)量明顯高于低溫誘導(dǎo)（表4）。

表4 翅萼石斛花高溫脅迫差異表達(dá)基因的KEGG分析

2.4 溫度應(yīng)答基因表達(dá)分析

在數(shù)據(jù)中查找低溫脅迫有關(guān)的應(yīng)答基因，識(shí)別了在脅迫信號(hào)感知受體中，鈣離子信號(hào)受體的34個(gè)鈣調(diào)磷酸酶B 類蛋白編碼基因（calcineurin B-like protein，CBL）、118 個(gè)絲裂原激活蛋白激酶基因（mitogen-activated protein kinase，MAPK）。CBF 途徑是植物最重要的低溫應(yīng)答通路，本試驗(yàn)識(shí)別了22個(gè)可能 的DREB/CBF（dehydration-responsive elementbinding protein/C-repeat binding factor）基因（表5）。如 DN36819_c0_g1_i1（DREB/CBF 1E）、DN73954_c1_g1_i2（DREB/CBF 2A 類似亞型X1）和DN86906_c0_g1_i1（DREB/CBF 2C 類似），在翅萼石斛花受低溫脅迫后上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)程度較小。DN23757_c0_g2_i1（DREB/CBF 2A 亞型 X1）、DN37118_c0_g4_i1（DREB/CBF 1G）、DN74449_c0_g 2_i2（DREB/CBF 2A 類 似）和DN78101_c0_g1_i1（DREB/CBF 1G），在低溫脅迫后下調(diào)表達(dá)；DN79705_c0_g1_i3（DREB/CBF 2A 類似亞型X2）和DN9972_c0_g1_i1（DREB/CBF 2E 類似）下調(diào)明顯。值得注意的是，DN30330_c0_g1_i1（DREB/CBF 2A亞型X2）、DN73954_c1_g1_i1（DREB/CBF 2A類似亞型X1）、DN73954_c1_g1_i2（DREB/CBF 2A類似亞型X1）、DN73954_c1_g1_i4（DREB/CBF 2A 類似亞型X1）、DN79705_c0_g1_i1（DREB/CBF 2A 類似亞型X2）和DN84346_c0_g1_i1（DREB/CBF 1C 類似），在翅萼石斛花受高溫脅迫后明顯上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明CBF基因不僅在低溫應(yīng)答中起作用，而且可能在植物高溫應(yīng)答中起到重要調(diào)控作用（表5）。

表5 翅萼石斛花低溫應(yīng)答基因舉例

在數(shù)據(jù)中查找高溫脅迫有關(guān)的應(yīng)答基因，在脅迫信號(hào)感知受體中，識(shí)別了3個(gè)可能的ELF（EARLY FLOWERING）基因，其中DN67438_c0_g1_i3（ELF5亞型X1）在翅萼石斛花受高溫脅迫后明顯下調(diào)表達(dá)。在高溫脅迫保護(hù)基因中，脂肪酸去飽和酶（fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）在高溫脅迫后降解，增加膜的飽和度以適應(yīng)高溫環(huán)境。本試驗(yàn)識(shí)別了21 個(gè)可能的FAD 基因。熱激蛋白（heat shock protein，HSP）能復(fù)性錯(cuò)誤折疊蛋白，減少毒性蛋白積累。本試驗(yàn)識(shí)別了82 個(gè)可能的HSP 基因，DN65656_c0_g1_i1（16.0 kDaHSP）、DN18591_c0_g1_i1（16.9 kDa 類型1HSP1）和 DN123520_c0_g1_i1（17.0 kDa 類型2HSP）等多個(gè)熱激蛋白基因在高溫脅迫后明顯上調(diào)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

在植物受到溫度脅迫后，低溫或高溫引起信號(hào)分子響應(yīng)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控一系列復(fù)雜的傳導(dǎo)過(guò)程，促使特定抗逆功能基因表達(dá)[4，9]。翅萼石斛是具有觀賞價(jià)值的藥用植物，溫度脅迫分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究利用低溫和高溫處理翅萼石斛花并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探討溫度脅迫對(duì)其主要代謝通路的影響，為揭示低溫和高溫調(diào)控抗逆反應(yīng)的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

由本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低溫和高溫處理后，翅萼石斛花中部分基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。KEGG富集分析結(jié)果表明，經(jīng)低溫誘導(dǎo)的差異表達(dá)，基因顯著富集途徑主要包括代謝和次生代謝途徑，而高溫誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因顯著富集途徑主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、RNA 降解、氨酰基tRNA 生物合成、淀粉和蔗糖代謝和甘油酯代謝，涉及的基因更多。具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。