李鎮(zhèn)江,楊志剛,唐曉芳,鄭又銘,陶繼文

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司,成都 611130;2.成都金開(kāi)生物工程有限公司,成都 611130;3.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 雅安 625014)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界上最重要的栽培水果之一,作為一種典型的非躍變水果,其生長(zhǎng)受內(nèi)源性和外源性因素調(diào)控[1]。赤霉素、乙烯、脫落酸、細(xì)胞分裂素等內(nèi)源性激素在葡萄的整個(gè)生命周期中發(fā)揮重要作用[2]。此外,多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如IBA、CPPU和TDZ[3],化合物如蔗糖[4],以及一些酶和轉(zhuǎn)錄因子都參與了葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。

PPOI是由好氧微生物利用糖類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性等性質(zhì),常用作防腐劑、保鮮劑、殺蟲(chóng)劑和抗菌劑等,被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品及化妝品等行業(yè)[6]。有研究表明,外源施加一定濃度的PPOI可提高小麥種子的發(fā)芽率,促進(jìn)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育[7]。但目前關(guān)于施加外源PPOI促進(jìn)葡萄生長(zhǎng)發(fā)育,以及導(dǎo)致這種情況的分子機(jī)制尚不清楚,有關(guān)PPOI應(yīng)用的研究報(bào)道主要集中在食品保鮮[8]、化妝品美白[9]以及相關(guān)的藥理作用方面[10],在農(nóng)業(yè)促生方面的研究還較少。為了揭示PPOI處理促進(jìn)“巨峰”葡萄生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制,本研究用不同濃度的PPOI處理葡萄,并對(duì)其根系和葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,為更深入地研究PPOI促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)選用16株10年生的“巨峰”葡萄苗(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供),其中4株為對(duì)照組,12株作為處理組(2‰、4‰、8‰濃度PPOI)種植于高40cm×寬50cm的營(yíng)養(yǎng)土中。在觀測(cè)到植物開(kāi)始有發(fā)芽跡象時(shí),開(kāi)始添加PPOI,每棵植株2L處理液,對(duì)照組加入相同體積的自來(lái)水,待處理5次后,取生長(zhǎng)速率最好的處理組及對(duì)照組的植株葉片和根系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4‰POOI促生效果最好,之后的實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行。(植株葉片：對(duì)照組(Lck)和處理組(L)各3個(gè)平行;植株根系：對(duì)照組(Rck)和處理組(R)各3個(gè)平行)。取完用液氮處理15min,放-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用RNA提取試劑盒TRIzol Reagent提取葡萄根和葉總RNA,Agilent 2100 Bioanalyzer測(cè)定RNA濃度和純度;通過(guò)Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA,隨后通過(guò)離子打斷的方式將mRNA隨機(jī)打斷。構(gòu)建cDNA文庫(kù)并進(jìn)行質(zhì)檢。將構(gòu)建好的文庫(kù)在Illumina測(cè)序儀上進(jìn)行PE150模式測(cè)序。測(cè)序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.3 序列數(shù)據(jù)處理

使用FastQC v0.11.8對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢查。過(guò)濾去除3′端帶接頭的序列;去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20的Reads。后續(xù)所有分析均是基于clean data進(jìn)行的高質(zhì)量分析。之后以歐洲葡萄“黑比諾”基因組作為參考基因組,使用利用HISAT2v2.0.5軟件將配對(duì)末端clean reads與參照基因組進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

采用FPKM對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,使用DESeq軟件(1.20.0)進(jìn)行PPOI處理根對(duì)照組(Rck)和處理組(R),葉對(duì)照組(Lck)和處理組(L)之間的差異表達(dá)分析。篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>2,顯著性P-value<0.05。隨后對(duì)差異表達(dá)基因做GO和 KEGG富集分析。

1.5 差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

依據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)進(jìn)行蛋白互作分析,揭示目的基因之間的作用關(guān)系。

1.6 葡萄產(chǎn)量的測(cè)定

于果實(shí)成熟期統(tǒng)計(jì)單株果穗數(shù)后,每個(gè)處理(對(duì)照組和4‰PPOI處理組)選樹(shù)冠大小、生長(zhǎng)勢(shì)相近的4株葡萄,每株在樹(shù)冠的東、南、西、北4個(gè)方向各取中等大小果穗2個(gè),迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定各指標(biāo),每處理取樣各40 穗。用電子天平稱(chēng)量單穗重并測(cè)定單產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序,得到12個(gè)樣品的原始數(shù)據(jù),對(duì)這些原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾,除去帶接頭、低質(zhì)量的Reads,原始數(shù)據(jù),樣品的clean data百分比在93.44%～93.76%,均在93%以上。由此得出,測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量已達(dá)要求,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 表達(dá)差異分析

各組間表達(dá)量差異分析結(jié)果如圖1,施加PPOI后,根系中共有1658個(gè)基因顯著差異,其中有837個(gè)基因顯著上調(diào);821個(gè)基因顯著下調(diào)(圖1a);葉片中共有463個(gè)基因顯著差異,其中有363個(gè)基因顯著上調(diào);100個(gè)基因顯著下調(diào)(圖1b);基于表達(dá)量的聚類(lèi)熱圖進(jìn)一步證實(shí)了上述基因的差異表達(dá)情況(圖1c)。綜合結(jié)果表明,向根系施加PPOI能夠顯著引起根系的基因表達(dá)響應(yīng),且對(duì)葉片中的基因表達(dá)也有一定程度的影響。

圖1 外源施加PPOI后葡萄根系和葉片中的差異表達(dá)基因篩選

2.3 差異表達(dá)基因GO富集分析

GO富集分析表明,根中差異表達(dá)基因的分子功能主要富集在DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄活性;細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞外周;生物學(xué)過(guò)程主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA模板和核酸模板轉(zhuǎn)錄調(diào)控等途徑(圖2a);葉片中差異表達(dá)基因的分子功能主要富集在DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄活性;生物學(xué)功能主要富集在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA模板化過(guò)程(圖2b)。綜合結(jié)論表明,無(wú)論是根還是葉片,施加PPOI后影響的主要過(guò)程是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。

圖2 外源施加PPOI后的GO功能富集和KEGG通路富集

2.4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

KEGG富集分析表明,根中差異表達(dá)基因主要參與了淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成、植物-病原體互作、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑(圖2c);葉片中差異表達(dá)基因主要參與了半乳糖代謝、植物-病原體互作、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、MAPK信號(hào)通路等途徑(圖2d)。

研究進(jìn)一步對(duì)外源施加PPOI后的葡萄根系和葉片差異表達(dá)基因富集的植物激素—信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行分析?；诓町惐磉_(dá)基因中“植物激素-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”途徑的富集結(jié)果,列出了基因集中與“脫落酸信號(hào)”(3個(gè))、“乙烯信號(hào)”(2個(gè))、“磷酸化途徑”(1個(gè))和“蛋白激酶”(3個(gè))相關(guān)的基因及其功能預(yù)測(cè)信息(表1)。結(jié)果顯示,在根系施加PPOI后上述基因的表達(dá)模式均有顯著性改變。

表1 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵富集基因信息

2.5 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子挖掘

為了深入挖掘施加PPOI后葡萄根系和葉片中具有明顯響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)(圖3)。

圖3 外源施加PPOI后葡萄根系和葉片差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子篩選

葉片中顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中,ERF(16個(gè),35.6%)、WRKY(7個(gè),15.6%)、NAC(4個(gè),8.9%)、MYB(3個(gè),3.7%)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子占比最大;根系顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中,MYB(3個(gè),21.24%)、bHLH(2個(gè),14.3%)、NAC(1個(gè),7.1%)、NF-YB(1個(gè),7.1%)、ERF(1個(gè),7.1%)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子占比最大(圖3 a)。

根系中顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中,ERF(24個(gè),31.6%)、bHLH(6個(gè),7.9%)、MYB(5個(gè),6.6%)、bZIP(5個(gè),6.6%)、NAC(4個(gè),5.3%)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子占比最大;葉片顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子中,ERF(19個(gè),16.8%)、MYB(12個(gè),14.3%)、bHLH(11個(gè),9.7%)、C2H2(10個(gè),8.8%)、NAC(8個(gè),7.1%)類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子占比最大(圖3 b)。

2.6 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

利用皮爾森相關(guān)系數(shù)計(jì)算基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián),并利用Cytoscape構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。輸入MYB、bHLH和ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子共85個(gè),苯丙烷代謝途徑、植物-病原體互作信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、淀粉-糖代謝途徑和光合作用相關(guān)基因共51個(gè);生成249對(duì)正相關(guān)關(guān)聯(lián)基因?qū)?7對(duì)負(fù)相關(guān)關(guān)聯(lián)基因?qū)?圖4a)。表明PPOI響應(yīng)下的轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)正向調(diào)控途徑基因表達(dá)產(chǎn)生應(yīng)答。轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,VvERF、VvMYB36、VvbHLH154、bHLH96是參與調(diào)控基因數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子;參與核苷酸代謝的核斑點(diǎn)RNA結(jié)合蛋白編碼基因VvRBP、參與糖類(lèi)-淀粉代謝途徑的葡萄糖1磷酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶編碼基因VvUDP、參與氧化應(yīng)激響應(yīng)的過(guò)氧化物酶編碼基因VvPOX是受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控影響最大的代謝途徑關(guān)鍵基因(圖4a)。施加PPOI后多種轉(zhuǎn)錄因子共同作用增強(qiáng)植物生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆響應(yīng)網(wǎng)絡(luò),促進(jìn)葡萄植株的生長(zhǎng)發(fā)育(圖4b)。

圖4 外源施加PPOI后轉(zhuǎn)錄因子與關(guān)鍵途徑基因調(diào)控網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)挖掘與潛在響應(yīng)模式

2.7 產(chǎn)量的測(cè)定

對(duì)4‰PPOI施加后的“巨峰”葡萄與未施加進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定,產(chǎn)量指標(biāo)包括單穗重和單株穗數(shù)及單產(chǎn)。結(jié)果顯示,施加4‰PPOI能顯著提高“巨峰”葡萄單穗重和產(chǎn)量,但對(duì)單株穗數(shù)提高并不顯著,對(duì)單產(chǎn)提升約為15%左右(表2)。

表2 PPOI處理后巨峰葡萄產(chǎn)量變化

3 討論與結(jié)論

對(duì)施加4‰濃度PPOI處理的葡萄根系和葉片及處理組根系和葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)葡萄根系組織基因中共有1658個(gè)基因顯著差異,在葡萄葉片組織中共有463個(gè)基因顯著差異,表明PPOI激活了葡萄植株的代謝。

在GO功能分析中,差異表達(dá)基因主要富集在生物學(xué)過(guò)程中DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在分子功能中主要富集于轉(zhuǎn)錄活性及細(xì)胞代謝。KEGG富集分析中,參與淀粉和蔗糖代謝,半乳糖代謝、苯丙烷生物合成等代謝途徑的基因明顯上調(diào)。綜合GO和KEGG富集結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),PPOI能增強(qiáng)植株的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及物質(zhì)代謝能力,從而發(fā)揮促生長(zhǎng)的作用。

植物激素在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)質(zhì)量發(fā)揮著重要的作用,有研究表明,植物的生長(zhǎng)是多種激素相互作用的結(jié)果[11]。激素的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)在決定細(xì)胞命運(yùn)、影響轉(zhuǎn)錄組、影響蛋白質(zhì)組、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等方面起著至關(guān)重要的作用[12]。本實(shí)驗(yàn)中植物激素—信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集得到脫落酸信號(hào)、乙烯信號(hào)、磷酸化途徑和蛋白激酶相關(guān)基因,表明外源施加PPOI影響了葡萄生長(zhǎng)發(fā)育激素的產(chǎn)生。從而多種激素共同作用促進(jìn)葡萄植株的生長(zhǎng)。

轉(zhuǎn)錄因子是參與真核生物基因表達(dá)的重要調(diào)控因子,對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性具有激活/抑制作用[13]。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子功能和代謝途徑富集分析結(jié)果推測(cè),乙烯信號(hào)響應(yīng)ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子可能參與植物激素與發(fā)育調(diào)控;MYB、bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)苯丙烷-木質(zhì)素途徑代謝調(diào)控,從而影響細(xì)胞壁發(fā)育;綜合多途徑基因表達(dá)調(diào)控共同影響葡萄植株在施加PPOI后的生長(zhǎng)發(fā)育。基于上述結(jié)果,我們提出一個(gè)PPOI促進(jìn)葡萄植株生長(zhǎng)的模型假說(shuō)：外源施加PPOI主要影響了葡萄根系和葉片中MYB、bHLH和ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá),進(jìn)而調(diào)控下游核苷酸代謝(影響細(xì)胞增殖)、葉綠體相關(guān)基因(影響光合作用)和抗氧化途徑基因(影響植物抗逆)的表達(dá)。通過(guò)增強(qiáng)植物生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆響應(yīng)網(wǎng)絡(luò),共同促進(jìn)葡萄植株的生長(zhǎng)發(fā)育。