余靜菠, 陳仕勇, 桑杰多吉, 張昌兵, 葉 莉, 姬文琴, 李 進(jìn)

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院, 四川 成都 610041;3.四川省阿壩州林業(yè)和草原局, 四川 馬爾康 62400; 4.四川省草原科學(xué)研究院, 四川 成都 611731)

老芒麥(ElymussibiricusL.)又稱西伯利亞披堿草,是禾本科披堿草屬中一種多年生異源四倍體牧草(2n=4x=28),含有St和H基因組[1]。它主要分布在我國的北方和青藏高原地區(qū),是我國高寒牧草的代表種之一;具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高、抗逆性強(qiáng)等特點,被廣泛應(yīng)用于天然草場改良和人工草場建設(shè),在青藏高原畜牧業(yè)和生態(tài)工程中發(fā)揮著重要作用[2]。

在自然進(jìn)化的過程中植物身處于不斷改變的環(huán)境,植物為了提高自身的生存能力,會進(jìn)化出特定的器官來應(yīng)對這些變化,例如在外稃頂端形成的芒[3]。芒是幼穗外稃延伸出的堅硬、長針狀結(jié)構(gòu)。在自然條件下,芒作為谷物上堅硬的部分,能掛在野生動物的皮毛上,有助于野生種質(zhì)的種子散布和掩埋,同時能防止蟲害以及鳥害[4-5]。但在畜牧業(yè)生產(chǎn)中長芒會造成不好的影響,有研究表明長芒對牧草的適口性和動物的營養(yǎng)需求有負(fù)面影響[6]。長芒降低了植物中的可消化營養(yǎng)物質(zhì),并且家畜在食用過程中可能會刺激胃并產(chǎn)生疼痛[7]。此外,長芒會妨礙收獲后的處理、儲存和加工活動,在生產(chǎn)應(yīng)用中往往需要進(jìn)行斷芒或去芒處理,為生產(chǎn)者帶來諸多不便[8],所以開展老芒麥短芒種質(zhì)的篩選和利用具有重要的意義。因此我們需要合理利用野生老芒麥進(jìn)行短芒型品種的培育,而國內(nèi)豐富的野生老芒麥資源,也為短芒型種質(zhì)的篩選和評價提供了便利的條件。

目前,前人對于禾本科植物中芒的調(diào)控機(jī)理的研究已有一定進(jìn)展。水稻中通過遺傳分析確定了幾個與芒的形成和伸長有關(guān)的基因,如調(diào)控芒形成的An-1和LABA1(An-2)、調(diào)控芒伸長的SLP1,DL(OsYABBY),OsETTIN2(OsARF2)RAE2和YABBY基因家族的Tob1(TONGARIBOUSHI1)[9-11]。大麥中,在早期Muller等[12]發(fā)現(xiàn)同源異型盒基因Knox3產(chǎn)生的帶帽結(jié)構(gòu),會致使異位分生組織在外稃上發(fā)育,從而不能形成正常的芒。大麥中抑制芒伸長的基因Lks2位于7H染色體上,編碼SHORTINTERNODES(SHI)家族轉(zhuǎn)錄因子[13]。本研究以在川西北高原收集的24份短芒型老芒麥種質(zhì)為研究材料,以老芒麥品種‘川草2號’和野生老芒麥‘Esxz’為對照,通過對短芒型老芒麥農(nóng)藝性狀和基于目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(Start codon targeted polymorphism,SCoT)分子標(biāo)記的遺傳多樣性評價,以期為短芒型老芒麥的育種等資源創(chuàng)制工作提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究共選用了26份老芒麥種質(zhì)資源,其中24份為聯(lián)合攻關(guān)課題組前期在四川紅原地區(qū)經(jīng)過多年評價篩選出的短芒型老芒麥種質(zhì)資源,同時選用1份國審品種‘川草2號’及1份采集于西藏的野生老芒材料麥(‘Esxz’)為對照(表1)。

表1 材料編號及名稱

1.2 試驗地概況

試驗地設(shè)置在四川省草原科學(xué)研究院牧草育種基地,基地位于阿壩藏羌自治州紅原縣境內(nèi),紅原縣海拔3 504 m,年均溫為1.1℃,年降水量為744 mm,氣候為大陸性高原寒溫帶季風(fēng)氣候,無絕對無霜期。冬季嚴(yán)寒,夏季涼爽春秋短,日照充足,晝夜溫差大。試驗地土壤為高山甸草土,pH值約為6.6。

1.3 研究方法

1.3.1形態(tài)指標(biāo)測定 每份材料隨機(jī)采集10個長勢一致的單株進(jìn)行測定,測定指標(biāo)分為數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀,其中質(zhì)量性狀通過觀察評分。本研究選取了5個質(zhì)量性狀,評分等級如下。

花序顏色:0——青色,1——紫紅色,2——紫綠色,3——淺紅色。葉片植株被粉:0——無粉,1——有粉?；~鞘被毛:0——無毛,1——少毛,2——多毛。桿生葉片被毛:0——無毛,1——少毛,2——多毛。葉片顏色:0——綠,1——藍(lán)綠,2——黃綠。

50個數(shù)量性狀于乳熟期(Milk stage,MS)測定,花序、小穗、稃片和穎片分別在上、中、底部測量(上部為距離頂端1/3處,中部為距離頂端1/3～2/3處,底端為距離2/3至最遠(yuǎn)處)。

莖稈性狀有:株高(Plant height)、莖長(Stem length)、莖節(jié)數(shù)(Number of stem nodes)、莖粗(Stem diameter)。

葉片性狀有:旗葉葉長(Flag leaf length)、旗葉葉寬(Flag leaf width)、倒二葉葉長(Penultimate leaf length)、倒二葉葉寬(Penultimate leaf width)。

花序性狀有:花序小穗數(shù)(Panicle number of inflorescence),上、中、底部的花序小穗數(shù)(Panicle number of inflorescence),花序節(jié)數(shù)(Number of inflorescence nodes)。

穗部性狀有:上、中、底部的穗節(jié)小穗長(Panicle length of inflorescence)、節(jié)間長(Internode Length of inflorescence)及小穗小花數(shù)(Floret number of inflorescence)。

穎片性狀有:上、中、底部的第一穎長(First glume length)、第一穎寬(First glume width)、第一穎芒長(First awn length of glume)、第二穎長(Second glume length)、第二穎寬(Second glume width)、第二穎芒長(Second awn length of glume)。

稃片性狀:上、中、底部的外稃長(Lemma length)、外稃寬(Lemma width)、內(nèi)稃長(Palea length)、內(nèi)稃寬(Palea width)。每份材料隨機(jī)采集10個長勢一致的單株,用卷尺、直尺和游標(biāo)卡尺進(jìn)行測定。

1.3.2DNA提取 每份材料隨機(jī)選取10株單株葉片進(jìn)行混合。采用植物DNA提取試劑盒DP305(北京天根生化科技有限公司)提取材料DNA,通過nanodrop測定其濃度與純度,并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性,根據(jù)檢測結(jié)果將DNA稀釋至10 ng·μL-1后,于-20℃冰箱待用。

1.3.3引物篩選及SCoT-PCR擴(kuò)增 本研究選用Collard等[14](SCoT1～SCoT36)及Luo等[15](SCoT37～SCoT80)報道的SCoT引物,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。選取8份材料對總共80個SCoT引物進(jìn)行引物的多態(tài)性篩選,共篩選出14對引物。根據(jù)擴(kuò)增條帶多態(tài)性,條帶清晰度來確定對應(yīng)退火溫度。

PCR擴(kuò)增總體積為15 μL,其中包括:6 μL模板DNA(10 ng·μL-1)、1.5 μL引物(10 μmol·L-1擎科生物技術(shù),北京,中國)、7.5 μLMix預(yù)混液(Es Taq DNA Polymerase,Mg2+,dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系)(天根生化科技,北京,中國)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD T100 Termal Cycler PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增程序為:94℃變性3 min;然后進(jìn)行36個循環(huán)的94℃變性1 min,48℃～55℃梯度退火1分鐘,72℃延伸2 min;最后在72℃下延伸5 min。待PCR程序結(jié)束后,在1倍的TAE緩沖溶液中用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像系統(tǒng)來觀察擴(kuò)增的結(jié)果并保存。

1.4 數(shù)據(jù)處理

形態(tài)觀察的數(shù)據(jù)處理與分析在SPSS 26.0進(jìn)行,對形態(tài)指標(biāo)的遺傳多樣性評價用變異系數(shù)、Shannon-Wiener’s多樣性指數(shù),同時進(jìn)行單因素方差分析。分別對50個數(shù)量性狀進(jìn)行等級劃分,根據(jù)性狀平均數(shù)(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)將其劃分為10個等級,1級≤x-2 s,10 級>x+2 s,中間每級間差0.5 s,利用SPSS軟件基于各形態(tài)指標(biāo)的平均數(shù)計算供試材料間的歐氏遺傳距離并進(jìn)行UPGMA聚類分析了解各種質(zhì)之間的親疏關(guān)系;對質(zhì)量性狀進(jìn)行賦值,按照公式H=-∑PilnPi來計算Shannon-Weaver’s遺傳多樣性。

對SCoT標(biāo)記結(jié)果,選取條帶清晰且多態(tài)性好的引物進(jìn)行統(tǒng)計,在相同遷移位置上,有帶記為1,無帶記為0,建立1,0矩陣。通過軟件POPGENE 1.32中計算多態(tài)性條帶百分比(Percentage of polymorphic bands,PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’ s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)。通過NTSYS-pc 2.10e軟件計算種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)(Genetic similarity coefficients,GS),并利用非加權(quán)組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic average,UPGMA)進(jìn)行聚類分析。利用軟件Structure 2.3.4分析老芒麥材料的群體結(jié)構(gòu)和ΔK來確定最優(yōu)分群數(shù)K,最終構(gòu)建群體結(jié)構(gòu)圖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 老芒麥形態(tài)指標(biāo)的變異分析

2.1.1質(zhì)量性狀 對26份老芒麥5個質(zhì)量性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析結(jié)果如表1所示,結(jié)果表明,花序顏色遺傳多樣性指數(shù)最高,為 1.24,基生葉鞘被毛遺傳多樣性為0.72,葉片植株被粉為0.63,葉片顏色為0.49,桿生葉被毛為0.56。由表可知,在5個質(zhì)量性狀中,遺傳多樣性指數(shù)大小為花序顏色>基生葉鞘被毛>葉片植株被粉>桿生葉被毛>葉片顏色(表2)。

表2 老芒麥5個質(zhì)量性狀的遺傳多樣性

2.1.2數(shù)量性狀 對26份老芒麥種質(zhì)50個數(shù)量性狀的分析表明(表3),每份材料各性狀存在較大的變異。除花序中部穗節(jié)小穗數(shù)、花序底部穗節(jié)小穗數(shù)、上部稃片外稃長、上部稃片內(nèi)稃長、中部稃片外稃長、中部稃片內(nèi)稃長、下部稃片外稃長外,其余的性狀的變異系數(shù)都大于10%,性狀變異系數(shù)的范圍為4.62%～45.93%,平均值為19.97%。其中,變異系數(shù)在30%以上的性狀有9個分別為:上部穎片第二穎寬(33.10%),上部穎片第一穎芒長(33.66%),上部稃片外稃芒長(36.70%),中部穎片第二穎芒長(37.16%),下部穎片第一穎芒長(37.67%),下部穎片第二穎芒長(37.92%),上部穎片第二穎芒長(39.69%),中部穎片第一穎芒長(40.08%),花序上部穗節(jié)小穗長(45.93%),可見26份老芒麥種質(zhì)變異主要來自于這9個性狀。數(shù)量性狀多樣性指數(shù)的平均值約為1.80,其中農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性指數(shù)最高是莖長(2.01),最低的是花序底部穗節(jié)小穗數(shù)(0.66)。

表3 老芒麥 50 個數(shù)量性狀的遺傳多樣性分析

對材料間外稃芒長進(jìn)行分析(圖1),外稃芒長平均值‘Esxz’最大,材料8最小,將供試材料分為5個差異顯著的組合(P<0.05),其中‘川草2號’及‘Esxz’外稃芒長平均值顯著大于本研究24份短芒型老芒麥外稃芒長(P<0.05),且8,24,26這三份材料外稃芒長平均值小于其他材料(P<0.05)。表明供試的老芒麥種質(zhì)具有芒短的穩(wěn)定形態(tài)特性。

圖1 26份材料外稃芒長的形態(tài)學(xué)特征

2.1.3基于農(nóng)藝性狀的聚類分析 聚類分析是研究種質(zhì)資源分類的有效方法之一,性狀越多,越能體現(xiàn)其實際情況,從而避免了僅以個別性狀進(jìn)行經(jīng)驗性分類的弊端。依據(jù)50個數(shù)量性狀對26份種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析,可將供試種質(zhì)分為五大類(圖2)。類群Ⅰ包括7份材料,材料編號分別為21,15,9,13,5,20,12,占26.92%,在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為,植株高大,花序節(jié)數(shù)多,穗長。類群Ⅱ包括4份材料,材料編號為11,7,19,17,占15.38%,在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為,稃片和穎片發(fā)達(dá)。類群Ⅲ包括5份材料,材料編號為14,10,25,2,23,占3.846 %,在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為植株莖稈粗、葉片長且寬、小穗數(shù)多,產(chǎn)量相關(guān)性狀優(yōu)越。類群Ⅳ包括5份材料,編號分別為26,8,4,1,24,占23.08%,在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為內(nèi)外穎、外稃長、芒長都是5個類群中最短,可以作為選育短芒型老芒麥的目標(biāo)親本加以利用。類群Ⅴ包括6,3,22,18,16,在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為植株矮小。

圖2 26份材料的聚類分析

2.2 基于SCoT標(biāo)記評價老芒麥種質(zhì)遺傳多樣性

2.2.1SCoT引物多態(tài)性分析 利用14個SCoT引物共擴(kuò)增出142條清晰條帶,平均每個引物擴(kuò)增10.1條,變幅為8條(SCoT7)～ 12條(SCoT38);多態(tài)性條帶共96條,平均每個引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶為6.9條,變幅為3(SCoT60)～10條(SCoT10),多態(tài)性比率(PPB)為67.61%;Ne變異范圍為1.306～1.661,平均為1.498;H范圍在0.165～0.325之間,平均為0.274;I范圍在0.237～0.500之間,平均為0.397。這說明了SCoT標(biāo)記對老芒麥具有良好的通用性與多態(tài)性,能夠用于老芒麥種質(zhì)的遺傳變異分析(表4)。

表4 14個SCoT引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2聚類分析 基于DICE遺傳相似系數(shù)構(gòu)建了各供試?yán)厦Ⅺ湻N質(zhì)的UPGMA聚類樹狀圖。如圖3,在遺傳相似系數(shù)為0.74處大致可將所有種質(zhì)劃分為3個類群,其中類群Ⅰ中包括材料26,3,13等,表明類群Ⅱ中的材料和審定品種‘川草2號’親緣關(guān)系非常近;類群Ⅱ中包括材料7,6,5等材料;材料‘Esxz’與其他種質(zhì)老芒麥的遺傳距離最遠(yuǎn),單獨聚為第Ⅲ類。

圖3 SCoT標(biāo)記對26份老芒麥種質(zhì)親緣關(guān)系聚類圖

2.2.3群體結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)Structure Harvester網(wǎng)頁的分析結(jié)果表明,供試材料被劃分為2個類群(K=2),分別標(biāo)記為Q1,Q2并利用Structure繪制26份老芒麥種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)圖(圖4)。本研究參照劉麗華等[17]的劃分方法,當(dāng)Q≥0.6表明材料血緣相對單一,Q<0.6則具有混合來源。Q1類群(Q<0.6)中有17份材料,65%的材料擁有混合來源,遺傳背景復(fù)雜;Q2類群(Q值>0.6)中有9份材料,表明材料來源單一,遺傳背景簡單,與其他類群基因交流較少。Q2類群(0.18)芒長平均數(shù)小于Q1類群(0.19),但Q2類群(3.50)芒長變異系數(shù)大于Q1類群(2.93);Q2類群(0.14)小穗平均數(shù)小于Q1類群(0.16),且Q2類群小穗數(shù)變異系數(shù)(48.69)小于Q1類群(49.69)。

圖4 26份老芒麥材料群體結(jié)構(gòu)分析

3 討論

植物表型性狀是其外部形態(tài)特征的綜合體,能夠直觀的表現(xiàn)其遺傳多樣性。植物在適應(yīng)和進(jìn)化的過程中會產(chǎn)生表型性狀的變異,增加群體表型的多樣性。變異系數(shù)的大小與群體表型多樣性豐富度呈正相關(guān)關(guān)系[18]。通過對植物表型性狀的分析研究,能夠在短時間內(nèi)了解植物的遺傳變異情況[19]。本研究將26份老芒麥種植于同一地點,使其生在相同的生境下,消除環(huán)境不同帶來的影響。對24份野生短芒型老芒麥55個形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行表型性狀多樣性研究結(jié)果表明,供試的種質(zhì)具有豐富的形態(tài)學(xué)變異水平,質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)在群體間的變化范圍為0.49～1.24,數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)在群體間的變化范圍為0.66～2.01,表明供試?yán)厦Ⅺ湹臄?shù)量性狀比質(zhì)量性狀存在更大的變異,這與尹婷婷等[20]在老芒麥遺傳多樣性分析中的結(jié)果一致。鄢家俊等[21]在對野生老芒麥居群穗部形態(tài)數(shù)據(jù)的研究中發(fā)現(xiàn),13個野生老芒麥的居群的芒長均大于1 cm,和本研究中兩份對照老芒麥測量數(shù)據(jù)一致,供試短芒型老芒麥的外稃芒長均值為0.604 cm,這一性狀顯著小于兩份對照材料,為短芒型老芒麥新品種的選育提供幫助。研究得到26份材料的數(shù)量性狀變異系數(shù)的范圍為4.62%～45.93%,相比于李瑤等[22]對59份老芒麥的研究變異系數(shù)更大,可能是本研究所測定形態(tài)指標(biāo)數(shù)量更多,產(chǎn)生了更豐富的形態(tài)多樣性,其中以中部穎片第一穎芒長、花序上部穗節(jié)小穗長最為突出,與芒相關(guān)性狀的變異系數(shù)也較大。表明材料中芒長的可塑性強(qiáng),對于已收集到的老芒麥材料應(yīng)根據(jù)其不同的特性加以利用,通過雜交育種和合理的栽培管理措施能達(dá)到理想的選擇效果。

遺傳多樣性是種質(zhì)資源研究中的重要內(nèi)容,本研究嘗試使用SCoT分子標(biāo)記,該標(biāo)記比簡單序列重復(fù)標(biāo)記(Simple sequence repeat,SSR)、DNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)、內(nèi)部簡單重復(fù)序列(Inter-simple sequence repeats,ISSR)成本低、多態(tài)性好,重復(fù)性高于隨機(jī)片段多態(tài)性標(biāo)記(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)[23-24]。本研究的結(jié)果表明,SCoT標(biāo)記可以有效地評估老芒麥種質(zhì)的遺傳多樣性,該標(biāo)記的多樣性數(shù)據(jù)高于之前報道的SRAP(I=0.2267,H=0.1508)[25],SSR(I=0.1930,H=0.1296)[25],ISSR(I=0.269,H=0.181)[26]和RAPD(I=0.263,H=0.176)[27]。說明SCoT引物對老芒麥種質(zhì)具有好的擴(kuò)增效果,能在野生老芒麥種質(zhì)中檢測出較豐富的遺傳多態(tài)性,將其用于短芒型老芒麥種質(zhì)資源種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析等研究是可行的。群體結(jié)構(gòu)分析可以用于評價野生老芒麥種質(zhì)的遺傳背景與親緣關(guān)系,對老芒麥雜交育種中的親本選配具有重要的指導(dǎo)作用。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明,65%的老芒麥種質(zhì)資源擁有混合來源,同一地區(qū)和類群間的野生老芒麥資源基因間存在著較為廣泛的交流。將綜合本研究中形態(tài)指標(biāo)對應(yīng)群體結(jié)構(gòu)來討論發(fā)現(xiàn),Q1類群芒短且Q1類群產(chǎn)量相關(guān)性狀更高,與Ntakirutimana等[28]研究結(jié)果一致,即芒長的增加導(dǎo)致每單株小花數(shù)減少,芒長與種子產(chǎn)量相互影響的結(jié)論一致,因此芒長這一性狀是影響種子產(chǎn)量的重要因素之一,短芒型材料的選育是高產(chǎn)育種的目標(biāo)親本。

使用形態(tài)標(biāo)記對種質(zhì)資源進(jìn)行研究長久以來是最有效的途徑之一,但環(huán)境因素及遺傳因素制約著表型性狀的表達(dá),具有一定的局限性。然而,消除環(huán)境變異的情況下,基于表型性狀的聚類和基于SCoT標(biāo)記的聚類不能完全對應(yīng),造成這一結(jié)果的原因可能是:(1)表型性狀的檢測水平有限,且植株生存環(huán)境的細(xì)微環(huán)境也會對其表型造成影響[29];(2)本研究所選SCoT引物不能將整個基因組的變異情況揭示完全,且有些發(fā)生在DNA水平的變異和表型性狀的改變沒有因果關(guān)系。盡管如此,本研究通過結(jié)合表型性狀與基因型變異分析,為其種質(zhì)資源提供綜合性評價,對加強(qiáng)短芒型老芒麥材料選育提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用形態(tài)學(xué)和SCoT分子標(biāo)記揭示了供試的短芒型老芒麥種質(zhì)具有豐富的遺傳變異;其中材料Esdm24,Esdm6,Esdm22這3份種質(zhì)的芒長及芒相關(guān)性狀較為優(yōu)異,可以作為短芒型老芒麥新種質(zhì)創(chuàng)制和品種選育的優(yōu)異種質(zhì)。