劉嘉偉, 王明玖*, 曹克璠, 何麗君, 郝新艷, 張慧敏, 郝 璐

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/草原與資源環(huán)境學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的種類、數(shù)量及其在內(nèi)外因素作用下變化規(guī)律的學(xué)科,是生物體在內(nèi)外因素共同作用下的最終結(jié)果。我們可通過代謝物的含量或濃度變化研究植物的生理狀態(tài)特征,從而對(duì)植物特定生化過程有更深層次的理解[1]。隨著時(shí)代的快速進(jìn)步,代謝組學(xué)技術(shù)多用于探究植物應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫的代謝物變化[2],對(duì)于分析豆科植物與根瘤菌共生固氮過程中代謝產(chǎn)物的變化也同樣發(fā)揮重要的作用。共生固氮是豆科植物和相應(yīng)根瘤菌之間發(fā)生的一系列復(fù)雜的化學(xué)和物理反應(yīng),包括引起雙方信號(hào)傳遞過程、寄主選擇和抑制植物防御系統(tǒng)的基因表達(dá)的變化。豆科植物—根瘤菌的相互作用通常始于氮貧瘠的土壤中,豆科植物分泌出類黃酮的代謝物[3-4],根瘤菌把類黃酮作為識(shí)別信號(hào),通過Nod基因進(jìn)行合成和釋放[5]。豆科植物根系分泌物中的黃酮類化合物在低氮條件下對(duì)根瘤菌有趨化信號(hào)作用[6],與異黃酮化合物一樣,黃酮類化合物同樣具有寄主特異性,有研究表明寄主特異性類黃酮與根瘤菌NodD蛋白相互作用,轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)Nod基因的表達(dá),導(dǎo)致Nod因子的產(chǎn)生[7-8],由寄主特異性Nod基因編碼產(chǎn)生的酶,會(huì)影響根瘤原基對(duì)寄主的選擇[9]。

高加索三葉草(Trifoliumambiguum)是一種多年生根蘗型豆科牧草,原產(chǎn)于東歐和高加索地區(qū),具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒性突出的特點(diǎn)[10],在原產(chǎn)地其能與根瘤菌結(jié)合進(jìn)行結(jié)瘤固氮作用[11-12],固氮效率與白三葉相似[13-14]。但是由于高加索三葉草對(duì)根瘤菌具有特異選擇性[15],當(dāng)引種至其他地區(qū)栽培時(shí),不能與根瘤菌發(fā)生互作關(guān)系,大多會(huì)失去結(jié)瘤和固氮能力,導(dǎo)致高加索三葉草前期建植能力弱,影響推廣種植。

由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)培育出的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’(TrifoliumambiguumBieb. ‘Mengnong No.1’)是中國(guó)第一個(gè)高加索三葉草品種,其適應(yīng)性強(qiáng)、生態(tài)位廣,在適應(yīng)性、耐牧性、生物產(chǎn)量方面優(yōu)于白三葉(T.repens)和紅三葉(T.pratence),更適合在北方寒冷地區(qū)生長(zhǎng)和種植[16-17]。經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’可以與本土根瘤菌結(jié)合,進(jìn)行結(jié)瘤固氮作用,突破了高加索三葉草不能與當(dāng)?shù)馗鼍Y(jié)合這一瓶頸。因此,本研究以‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’為研究對(duì)象,探究與根瘤菌相互作用的機(jī)理,研究根瘤菌對(duì)根系代謝物的影響,對(duì)解釋高加索三葉草結(jié)瘤固氮機(jī)理,為增強(qiáng)高加索三葉草的結(jié)瘤固氮能力提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的高加索三葉草品種‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’。供試菌株為‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根瘤中分離得到的根瘤菌,經(jīng)過16S rDNA鑒定為豌豆屬根瘤菌(RhizobiumLeguminosarum)。

1.2 樣品的處理及采集

幼苗培養(yǎng):選取籽粒飽滿的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’種子200粒,用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒10 min,無菌水沖洗干凈后,置于鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中,26℃避光萌發(fā)4 d。將萌發(fā)后的幼苗移栽至裝滿無菌蛭石的10 cm×10 cm的黑色營(yíng)養(yǎng)缽中,每缽移栽3株,施加100 mL的無菌Hoagland無氮營(yíng)養(yǎng)液。將營(yíng)養(yǎng)缽置于光照培養(yǎng)箱中(26℃;光照16 h/黑暗8 h;相對(duì)濕度50%)繼續(xù)培養(yǎng)1 d后,進(jìn)行試驗(yàn)。

Hoagland無氮營(yíng)養(yǎng)液:435 mg·L-1K2SO4;136 mg·L-1KH2PO4;241 mg·L-1MgSO4;36.7 mg·L-1FeNaEDTA;0.83 mg·L-1KI;6.2 mg·L-1H3BO3;16.9 mg·L-1MnSO4·H2O;8.6 mg·L-1ZnSO4·7H2O;0.25 mg·L-1Na2MoO4·2H2O;0.025 mg·L-1CuSO4·5H2O;0.025 mg·L-1CoCl2·6H2O;444 mg·L-1CaCl2。

根瘤菌菌懸液的制備:將前期已經(jīng)分離并鑒定得到的根瘤菌分別接種至YMA液體培養(yǎng)基中[18],于180 r·min-1、28℃振蕩培養(yǎng)至光密度值(OD600值)>0.5時(shí),10 000 r·min-1離心10 min,倒掉上清液用無菌水配置成OD600值為0.5的菌懸液,備用。

試驗(yàn)處理:試驗(yàn)設(shè)置接種根瘤菌和不接種根瘤菌(CK)2個(gè)處理。接種根瘤菌處理方法為:在無菌條件下,在移栽有3株幼苗的黑色營(yíng)養(yǎng)缽中,用移液槍將1 mL根瘤菌菌懸液(OD600=0.5)滴至每株幼苗根部后,添加100 mL無氮Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,將其置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。不接種根瘤菌(CK)處理方法為:在無菌條件下,在移栽有3株幼苗的黑色營(yíng)養(yǎng)缽中,在幼苗添加100 mL無氮Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,將其置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理重復(fù)10缽。光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為:溫度26℃;光照16 h/黑暗8 h;相對(duì)濕度50%。將培養(yǎng)9 d的不同處理的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’幼苗根系用液氮速凍,并于-80℃保存?zhèn)溆?其中接種根瘤菌的樣品編號(hào)為G_9,不接種根瘤菌(CK)的樣品編號(hào)為CK_G_9,每組樣品設(shè)置6次重復(fù)。

1.3 根系代謝產(chǎn)物的LC-MS分析

將“1.2”中的樣品G_9和CK_G_9送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,利用非靶向代謝技術(shù)(LC-MS/MS)進(jìn)行代謝產(chǎn)物的定性定量分析。將‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系進(jìn)行前期處理,將得到的上清液進(jìn)行上機(jī)分析,運(yùn)用AB-SCIEX公司的超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜UPLC-TropleTOF系統(tǒng)進(jìn)行LC-MS分析。取等體積的所有樣本代謝物混合制備成質(zhì)控樣品(Quality control,QC),在儀器分析過程中,每10個(gè)樣品中插入1個(gè)QC樣品,以考察整個(gè)分析過程的重復(fù)性。將得到的LC-MS原始數(shù)據(jù)運(yùn)用Progenesis QI(Waters Corporation,Milford,USA)進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊,最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣,將MS和MSMS質(zhì)譜信息與代謝公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配,得到代謝物信息[19]。

預(yù)處理后的數(shù)據(jù)上傳至美吉生物云平臺(tái)上(https://cloud.majorbio.com)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用R軟件包ropls(Version1.6.2)進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA),對(duì)數(shù)據(jù)的可靠性進(jìn)行初步判定。對(duì)得到的可靠數(shù)據(jù)進(jìn)行Student’s t檢驗(yàn)和差異倍數(shù)分析?；赑LS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP)和student’s t檢驗(yàn)P值來確定差異代謝物,VIP >1、P<0.05的代謝物即為顯著差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系結(jié)瘤情況

‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種根瘤菌后,根系出現(xiàn)了結(jié)瘤現(xiàn)象(圖1)。根瘤數(shù)量、根瘤重量與根瘤面積在接種根瘤菌后出現(xiàn)了顯著性的增加(P<0.05)(表1)。

表1 接種與未接種根瘤菌的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’結(jié)瘤情況比較

圖1 接種與未接種根瘤菌的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’結(jié)瘤及生長(zhǎng)情況對(duì)比

2.1 接種根瘤菌的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中代謝產(chǎn)物的主成分分析

對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析,G_9與CK_G_9樣品間相互分離,證實(shí)試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確且可靠。處理間存在顯著的差異,在圖中距離較遠(yuǎn),說明重復(fù)性較高。QC重疊在一起,說明檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)可靠性高,可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)(圖2)。

圖2 接種與未接種根瘤菌的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中代謝產(chǎn)物的主成分分析

2.2 接種根瘤菌的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中代謝產(chǎn)物的偏最小二乘判別分析

通過對(duì)不同處理下根系代謝產(chǎn)物進(jìn)行PLS-DA分析,不同處理下的樣品均分列于兩側(cè),說明兩組樣品分離程度較大(圖3)。通過PLS-DA置換檢驗(yàn)(圖4),并對(duì)模型進(jìn)行參數(shù)計(jì)算,樣品間的模型主要質(zhì)量參數(shù)R2X為0.513,R2Y為0.991,Q2為0.937,說明PLS-DA模型穩(wěn)定可靠性較好(表2)。

表2 PLS-DA模型參數(shù)表

圖3 接種和未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中代謝產(chǎn)物的偏最小二乘判別分析

圖4 接種和未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中代謝產(chǎn)物的偏最小二乘判別分析的置換檢驗(yàn)

2.3 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物分析

運(yùn)用單維分析(t檢驗(yàn))和多維分析PLS-DA相結(jié)合的方法(VIP>1,P<0.05),得到接種與未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物(Differential Metabolite,DAM),結(jié)果共篩選出249個(gè)DAMs(圖5)。

圖5 接種與未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物的火山圖

2.4 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物的KEGG通路分析

對(duì)全部的DAMs進(jìn)行KEGG統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),DAMs在新陳代謝過程中分別在“次生代謝產(chǎn)物的生物合成”“氨基酸代謝”“碳水化合物代謝”“其他氨基酸代謝”“核苷酸代謝”和“輔助因子和維生素代謝”中注釋15,9,4,4,3和3個(gè)DAMs;在遺傳信息處理中,DAMs在“翻譯過程”中注釋到2個(gè);在環(huán)境信息處理中,DAMs在“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“膜運(yùn)輸過程”中分別注釋了1和3個(gè)(圖6)。

圖6 接種與未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物的KEGG通路分析

2.5 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物KEGG富集分析

對(duì)DAMs進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),共有75個(gè)DAMs富集在47個(gè)KEGG通路中,其中主要富集在黃酮和黃酮醇的生物合成,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,類黃酮生物合成,乙醛酸和二羧酸代謝和檸檬酸循環(huán)通路,在泛酸鹽和輔酶A的生物合成、賴氨酸生物合成、組氨酸代謝、甘油磷脂代謝、賴氨酸降解、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和苯丙烷代謝通路中也有富集(圖7)。

圖7 接種與未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物的KEGG富集分析

2.6 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中差異代謝物種類及其數(shù)量的變化

對(duì)接種與未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中的DAMs進(jìn)行KEGG化合物分類,發(fā)現(xiàn)22種DAMs屬于不同化合物類型,其中有9種DAMs屬于類黃酮類化合物,分別為黃豆黃甙、異鼠李素、黃芪甲素、山奈酚、槲皮素、楊梅素、蟛蜞菊內(nèi)酯、異山奈和根皮苷,含量均表現(xiàn)為顯著增加;有2種DAMs屬于苯丙素類化合物,分別為香豆素和芥子醇,其中香豆素含量顯著增加,芥子醇含量顯著降低。蜜二糖是唯一的糖類化合物,含量顯著增加。在其余化合物中,除檸檬酸和壬二酸外,其他均表現(xiàn)為含量顯著增加(表3)。

表3 接種與未接種根瘤菌‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系中的主要差異代謝物

2.7 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系結(jié)瘤關(guān)鍵通路中差異代謝物的變化分析

對(duì)DAMs的KEGG通路及富集情況進(jìn)行整理分析,共有16種化合物的含量在TCA循環(huán)、苯丙素生物合成和類黃酮生物合成過程中發(fā)生變化(圖8)?！赊r(nóng)三葉草1號(hào)’接種根瘤菌后,類黃酮生物合成途徑中的根皮苷、山奈酚、槲皮素、楊梅素和黃豆黃甙含量顯著增加。苯丙素生物合成過程中的香豆素和香草醛含量顯著增加,芥子醇含量顯著降低(表4)。‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’與根瘤菌結(jié)合后,酮戊二酸、精氨酸和天冬氨酸含量顯著增加,促進(jìn)了苯丙素和類黃酮生物合成過程。類黃酮化合物含量增加,促進(jìn)了‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’與根瘤菌的相互作用。

表4 接種根瘤菌后‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系結(jié)瘤關(guān)鍵通路差異代謝物含量變化

圖8 接種根瘤菌后‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系結(jié)瘤關(guān)鍵通路中差異代謝物的變化

3 討論

‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種根瘤菌后,鑒定到的DAMs主要參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸代謝過程、膜運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)體可以參與植物對(duì)細(xì)菌的生物脅迫與非生物脅迫的反應(yīng),在大豆(GlycinemaxMerr.)中,ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)體可以參與根系化合物的分泌,在結(jié)瘤過程中起到重要的作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn),‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’在結(jié)瘤過程中,DAMs在ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)體通路中顯著富集,說明ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)體也參與了‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’結(jié)瘤固氮作用。

在植物體三羧酸循環(huán)中,酮戊二酸主要參與能量的代謝,是碳氮代謝過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[22],它能反映植物碳氮代謝情況,也是調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和代謝相關(guān)酶的信號(hào)分子[23]。豆科植物根瘤菌將氮固定成氨的過程是通過谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶催化完成的[24],酮戊二酸可以對(duì)硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶和谷氨酰胺合成酶進(jìn)行催化作用[25],從而促進(jìn)氮代謝過程?！赊r(nóng)三葉草1號(hào)’接種根瘤菌后,酮戊二酸含量顯著增加,意味著根瘤菌促進(jìn)了‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系酮戊二酸含量的增加,加速了谷氨酰胺合成酶催化作用,促進(jìn)氮代謝過程。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種根瘤菌后,根系中精氨酸含量顯著增加,有可能是由于酮戊二酸促進(jìn)了氨基酸含量的變化。精氨酸可以貯藏氮素營(yíng)養(yǎng),生成的前體物質(zhì)可以參與植株的生長(zhǎng)、抗逆性等生理生化作用,有利于促進(jìn)豆科植物根瘤的生長(zhǎng)[26]。研究發(fā)現(xiàn),植物在缺氮情況下,根系天冬氨酸含量明顯下降[27]。Bacanamwo等[28]認(rèn)為,根瘤的固氮活性與天冬氨酸有關(guān)。本研究中,‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系天冬氨酸含量顯著增加,說明其在接種根瘤菌9 d時(shí),天冬氨酸促進(jìn)了根瘤菌定殖和結(jié)瘤作用。

本研究對(duì)接種根瘤菌后的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系代謝物進(jìn)行分析,對(duì)得到的DAMs進(jìn)行KEGG化合物分類,共有9種化合物屬于黃酮類化合物。在豆科植物與根瘤菌共生過程中,類黃酮化合物是關(guān)鍵的信號(hào)分子化合物[20],可以傳導(dǎo)豆科植物早期結(jié)瘤信號(hào),并對(duì)結(jié)瘤基因進(jìn)行誘導(dǎo)。因此,類黃酮化合物作為宿主特異性固氮共生體,對(duì)維持根瘤菌與植物共生至關(guān)重要。

類黃酮是植物中苯丙酸代謝和乙酸—丙二酸途徑的次生代謝產(chǎn)物。所有的黃酮類化合物都是莽草酸途徑產(chǎn)生的苯丙氨酸和乙酰輔酶A羧化反應(yīng)產(chǎn)生的丙二酰輔酶A的衍生物[29]。有研究表明,在接種根瘤菌時(shí)添加黃酮誘導(dǎo)劑,可以增加根瘤菌在土壤中的競(jìng)爭(zhēng)力[30-31]。黃酮類化合物山奈酚和槲皮素受黃酮-3’-羥化酶(F3’H)和黃酮-3’,5’-羥基化酶(F3’5’H)催化,可以生成楊梅素[32]。山奈酚可以作為根瘤菌的誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)根瘤菌定殖在豆科植物根系中[33]。本研究中,接種根瘤菌后,‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根系山奈酚、槲皮素和楊梅素含量顯著增加,說明類黃酮化合物山奈酚、槲皮素和楊梅素均在‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’早期結(jié)瘤過程起到了促進(jìn)作用[34]。

香豆素化合物是植物合成的重要次級(jí)代謝物,除了在植物攝取鐵的過程中起作用,還可以作為共生細(xì)菌、病原體的信號(hào)分子,具有抗菌和抗病毒的特性[35]。有益微生物可以誘導(dǎo)香豆素分泌到植物根際,保護(hù)植物免受致病性攻擊[36]。也有研究發(fā)現(xiàn),香豆素會(huì)抑制固氮細(xì)菌的生長(zhǎng)和固氮作用[37]。本研究中,‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’在接種根瘤菌后,香豆素含量顯著增加,說明在根瘤菌進(jìn)入根系后觸發(fā)了香豆素的保護(hù)機(jī)制,但后期對(duì)結(jié)瘤的影響目前還不明確,需要進(jìn)一步研究。

‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’在接種根瘤菌后,可能導(dǎo)致TCA循環(huán)中酮戊二酸與檸檬酸含量的變化,從而引發(fā)部分氨基酸,如精氨酸與天冬氨酸含量的顯著增加。由精氨酸合成的泛酰硫氫乙胺的含量的增加誘導(dǎo)類黃酮生物合成和苯丙素生物合成中的部分黃酮類化合物顯著增加,釋放Nod因子,從而促進(jìn)根瘤菌的定殖和結(jié)瘤過程。

4 結(jié)論

本研究首次運(yùn)用代謝組學(xué)測(cè)序技術(shù),對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種根瘤菌后的根系代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析,共鑒定到249個(gè)差異代謝物。其中,精氨酸、天冬氨酸、酮戊二酸、山奈酚、槲皮苷、根皮苷、楊梅素和黃豆黃甙含量顯著增加,促進(jìn)了‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’與根瘤菌的結(jié)合,這8種代謝物是影響結(jié)瘤過程的關(guān)鍵代謝物。