◎ 田 翠，張維娜，羅小嬌，鄭海芳，張 強(qiáng)，金 偉，劉 霜

（瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 瀘州 646000）

磺胺類藥物是具有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類抗菌藥物的總稱，其粉末一般為黃色或白色，基本無(wú)味。磺胺類藥物可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，具有價(jià)格低、抗菌能力強(qiáng)、容易吸收等特點(diǎn)，被廣泛用于獸醫(yī)臨床和畜牧業(yè)，以預(yù)防和治療畜禽細(xì)菌性疾病，但磺胺類藥物的不合理使用、誤用，甚至濫用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性日益增強(qiáng)[1-6]?；前奉愃幬锟梢杂绊懨谀蛳到y(tǒng)功能，甚至誘發(fā)癌變。磺胺類藥物代謝時(shí)間較長(zhǎng)，一旦人們長(zhǎng)期服用帶有磺胺類藥物殘留的食品，磺胺類藥物會(huì)在人體內(nèi)富集，富集濃度超過(guò)一定量對(duì)人體有害?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定磺胺類藥物及其殘留標(biāo)志物之和不得超過(guò)100 μg·kg-1[7]。

目前，肌肉組織中磺胺類藥物的檢測(cè)方法很多，主要有毛細(xì)管電泳分析法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射性免疫法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-16]。本文提出了乙酸乙酯提取，0.1 mol·L-1的鹽酸溶液轉(zhuǎn)化溶劑，正己烷除脂肪，MCX 柱凈化，外標(biāo)法定量，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉樣品中5 種磺胺類藥物的方法，其背景干擾少，靈敏度高，重復(fù)性好，能快速、高效、高分辨地定性、定量檢測(cè)，該方法適用于大批量的豬肉中磺胺類藥物的檢測(cè)，可為日常監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺 胺 二 甲 基 嘧 啶（Sulfamethazine，SM2）100 μg·mL-1、磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）100 μg·mL-1、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ）100 μg·mL-1、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）100 μg·mL-1和磺胺喹惡啉（Sulfaquinoxaline，SQX）100 μg·mL-1；試劑用純凈水（屈臣氏純水）；乙酸乙酯、甲醇、正己烷、甲酸、乙腈均為色譜純；鹽酸、氨水為優(yōu)級(jí)純；0.1 mol·L-1鹽酸溶液（量取0.83 mL 濃鹽酸，倒入適量的純水中，加水稀釋至100 mL，搖勻）；洗脫液（量取5 mL 氨水，倒入適量的甲醇中，加甲醇稀釋至100 mL，搖勻）；5%的甲醇溶液（取5 mL 甲醇，用水溶解后稀釋至100 mL，搖勻）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫6460）；渦旋振蕩器；高速離心機(jī)（冷凍）；MCX 柱60 mg/3 mL（島津）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取新鮮或解凍的豬肉若干小塊或全部樣品預(yù)處理，切碎、混勻，四分法縮分。取縮分樣品，充分勻漿，分別裝入潔凈塑料瓶中密封，標(biāo)識(shí)。

1.3.2 測(cè)定步驟

（1）提取。稱取樣品（5.0±0.05）g 于50 mL 的離心管中，加入一顆陶瓷均質(zhì)子和20 mL 乙酸乙酯，劇烈振蕩2 min，5 000 r·min-1離心5 min（離心機(jī)溫度設(shè)置-2 ℃左右），用滴管將上清液吸取到50 mL的雞心瓶中，殘?jiān)屑尤?0 mL 乙酸乙酯，按步驟重復(fù)提取1 次，2 次提取液合并后備用。

（2）凈化。將4 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液加到雞心瓶中，40 ℃旋蒸至溶液不分層（乙酸乙酯旋出，只剩鹽酸溶液），將殘留的溶液轉(zhuǎn)至50 mL 的離心管中，用2 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液洗滌雞心瓶2 次，將洗滌液轉(zhuǎn)移至同一個(gè)離心管中，再用5 mL 的正己烷洗滌雞心瓶，并轉(zhuǎn)移至含有鹽酸溶液的離心管中，渦旋振蕩1 min，5 000 r·min-1離心5 min（離心機(jī)溫度設(shè)置-2 ℃左右），用一次性滴管將正己烷吸出棄去。MCX 柱分別用2 mL 甲醇和2 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液活化，取備用液過(guò)柱，依次用1 mL 的0.1 mol·L-1鹽酸溶液和2 mL 甲醇淋洗，棄去流出液體，當(dāng)MCX柱液面沒(méi)有液體時(shí)，加入6 mL 洗脫液，用10 mL 試管收集洗脫液。將洗脫液40 ℃氮?dú)獯抵两?，?%的甲醇溶液溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，0.2 μm 濾膜過(guò)濾，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）5 μg·mL-1磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取0.50 mL 的100 μg·mL-1的5 種磺胺標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，稀釋至刻度，配制成5 μg·mL-1的磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃以下的冰箱中保存。

（2）1 μg·mL-1磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取2.00 mL 的5 μg·mL-1磺胺儲(chǔ)備液于10 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解，稀釋至刻度，配制成1 μg·mL-1的磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃以下的冰箱中保存。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。準(zhǔn)確吸取1 μg·mL-1磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用5%的甲醇溶液配制成10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液，4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱為安捷倫C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為甲醇；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流速0.2 mL·min-1。色譜柱梯度淋洗條件見表1。

表1 梯度淋洗條件表

質(zhì)譜條件：離子源AJS ESI；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；霧化器壓力45 psi；干燥氣溫度250 ℃；鞘氣溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓4 000 V。定量定性離子、保留時(shí)間等參數(shù)見表2。

表2 磺胺類藥物的主要液質(zhì)參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 方法選擇

目前，肌肉組織中磺胺類藥物的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其中酶聯(lián)免疫吸附法重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，易造成假陽(yáng)性的誤判；《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測(cè)定 高效液相色譜法》（GB 29694—2013）中的高效液相色譜法檢出限高，根據(jù)保留時(shí)間定性，儀器不穩(wěn)定或有雜質(zhì)峰的影響，會(huì)出現(xiàn)誤判的情況，且為達(dá)到較好的分離效果一般選用C18色譜柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），流動(dòng)相梯度淋洗時(shí)間較長(zhǎng)，不利于大批量樣品的上機(jī)處理；《畜禽肉中16 種磺胺類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 20759—2006）采用乙腈提取，無(wú)水硫酸鈉吸水，雖然操作簡(jiǎn)單，但是無(wú)水硫酸鈉吸水時(shí)，對(duì)磺胺類藥物也有一定的吸附作用，導(dǎo)致回收率降低，且沒(méi)有經(jīng)過(guò)固相萃取柱的凈化，會(huì)對(duì)液相色譜的管道和色譜柱造成污染，也會(huì)對(duì)質(zhì)譜的離子源造成污染；《動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1025 號(hào)公告—23—2008）中洗脫液有75%的水，低溫氮吹時(shí)很難吹干，高溫氮吹時(shí)磺胺類藥物易分解，導(dǎo)致回收率低和精密度差。本文用乙酸乙酯提取，0.1 mol·L-1酸溶液轉(zhuǎn)化溶劑，正己烷除脂肪，MCX 柱凈化，5%的氨水甲醇洗脫，氮吹至近干，操作簡(jiǎn)單，定性、定量準(zhǔn)確。

2.2 濃縮

濃縮時(shí)將乙酸乙酯全部蒸干，再加鹽酸溶液，少量多次轉(zhuǎn)移，磺胺類藥物回收率降低。乙酸乙酯蒸干后，脂類物質(zhì)粘壁，磺胺類藥物也粘壁，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移不徹底，回收率降低。在提取液中加入鹽酸溶液，根據(jù)鹽酸溶液和乙酸乙酯的沸點(diǎn)不同，先將乙酸乙酯蒸去，大部分磺胺類藥物溶解在鹽酸相中，再用正己烷分2 次洗雞心瓶，可以把脂肪和少量粘在壁上的藥物轉(zhuǎn)移出來(lái)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)控制水浴溫度40 ℃（水浴溫度過(guò)高，熱不穩(wěn)定的藥物會(huì)分解，回收率降低；水浴溫度過(guò)低，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的時(shí)間較長(zhǎng)，不利于大批量樣品的檢測(cè)），減壓干燥至收集瓶中無(wú)大量液滴滴下，所剩體積大約為4 mL。

2.3 除脂肪

使用正己烷脫脂時(shí)，渦旋時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，渦旋力度也不宜過(guò)大，否則溶液會(huì)發(fā)生乳化現(xiàn)象。萃取中應(yīng)防止乳化現(xiàn)象，以免乳狀液中溶解的磺胺類藥物不能回收，降低回收率，影響重復(fù)性。一旦發(fā)生乳化，需要消除乳化，常用的破乳方法有離心、加熱、超聲、冷凍和加鹽等，待乳化消失再過(guò)柱。

2.4 凈化

磺胺類藥物呈酸堿兩性，易溶于酸液和堿液中，故可使用離子交換SPE 柱作為凈化富集的手段。本方法用MCX 柱，MCX 小柱可以提供反相保留和離子交換兩種模式，適用于堿性化合物的陽(yáng)離子交換和反相吸附。上樣步驟及溶液使用原因如下。

2.4.1 活化

加入甲醇浸潤(rùn)柱子，并除去柱內(nèi)雜質(zhì)，鹽酸溶液可以創(chuàng)造一個(gè)樣品溶劑相容環(huán)境，為待測(cè)組分的上樣和淋洗做好準(zhǔn)備。

2.4.2 上樣

根據(jù)離子化原理，上樣液的pH 值應(yīng)低于待測(cè)組分pH 值，絕大部分的待測(cè)組才可解離為離子，所以選擇酸性較大的水溶液為上樣液。

2.4.3 淋洗

用鹽酸溶液淋洗，可以解除藥物與基質(zhì)蛋白的結(jié)合，使藥物繼續(xù)保持于柱體上，再用甲醇淋洗，去除較多的極性雜質(zhì)。

2.4.4 洗脫

洗脫液過(guò)少，洗脫不完全會(huì)導(dǎo)致回收率偏低；洗脫液過(guò)多，雜質(zhì)可能洗脫下來(lái)，干擾上機(jī)檢測(cè)，且洗脫液過(guò)多，氮吹較慢，不利于大批量樣品的檢測(cè)。本方法選擇6 mL 的洗脫液。

2.4.5 氮吹

氮吹不宜吹干，吹干后回收率降低、重現(xiàn)性變差，原因在于沒(méi)有溶液的保護(hù)，磺胺類藥物分解或被吹跑。氮吹至液面近干，回收率高、重現(xiàn)性好。

2.4.6 復(fù)溶

樣品濃縮后，復(fù)溶溶劑的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。復(fù)溶不充分會(huì)導(dǎo)致回收率降低和重現(xiàn)性差。一般復(fù)溶液最好與流動(dòng)相的初始比例相同，避免對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾。本方法初始流動(dòng)相是5%的甲醇溶液，此溶液對(duì)磺胺類藥物的溶解性好，因此選擇5%甲醇溶液溶解殘?jiān)?/p>

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制標(biāo)準(zhǔn)濃度系列曲線，5 種磺胺類藥物用5%的甲醇溶液配制成10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，上機(jī)測(cè)試。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.999 3 ～0.999 9，線性關(guān)系良好，均大于0.999。以10 倍信噪比確定5 種磺胺類的定量限，5 種磺胺類的定量限均為1 μg·kg-1，說(shuō)明該方法的靈敏度滿足藥物殘留分析的要求，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)及定量限見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)表

2.6 回收率和精密度

在豬肉基質(zhì)中添加濃度為10 μg·kg-1、40 μg·kg-1、60 μg·kg-1和100 μg·kg-1的磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定回收率，每個(gè)添加水平測(cè)定3 次，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）結(jié)果見表4。獸藥殘留檢測(cè)的方法一般要求回收率在60%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差一般≤15%（RSD ≤15%）。5 種磺胺類藥物的回收率均在61%～87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.12%～4.96%，符合獸藥殘留檢測(cè)規(guī)范要求。

表4 添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表

3 結(jié)論

本方法建立了豬肉中磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑和磺胺喹惡啉5 種常用的磺胺類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測(cè)方法。該方法具有良好的線性關(guān)系，定量限為1 μg·kg-1，在10 μg·kg-1、40 μg·kg-1、60 μg·kg-1和100 μg·kg-1的加標(biāo)水平上，回收率為61%～87%，RSD 為2.12%～4.96%，準(zhǔn)確、高效，適用于大批量樣品的定性和定量檢測(cè)，為豬肉中磺胺類藥物的檢測(cè)提供了有效的技術(shù)支撐。