◎ 魏金梅，鐘國慶，謝美珍，胡 陽，宋曉園，李桂琴，王 磊

（贛州市綜合檢驗檢測院，江西 贛州 341000）

中藥飲片的品質(zhì)決定著中成藥的質(zhì)量，影響著用藥患者的健康安全[1]。《中華人民共和國藥典（2020年版）》四部通則1107 中對直接口服及泡服飲片的微生物限度標準進行了明確的規(guī)定，相較于2015 年版藥典對中藥飲片的規(guī)定，新增了需氧菌總數(shù)（限量105CFU·g-1或CFU·mL-1）、霉菌和酵母菌總數(shù)（限量103CFU·g-1或CFU·mL-1）等檢驗項目，此外還規(guī)定每1 g 或1 mL供試品中不得檢出大腸埃希菌[2]。這表明，我國對中藥飲片的質(zhì)量把控日趨嚴格，但目前國內(nèi)仍有許多品種的中藥飲片尚未探究出合適的微生物限度檢查方法。

干姜是姜科植物姜（Zingiber officinaleRose.）的干燥根莖，味辛，性熱，其主要含有揮發(fā)油類、姜辣素類等化合物。干姜是藥食兩用的中藥，在食品和醫(yī)藥行業(yè)應用廣泛，具有抗炎抑菌、抗氧化、保護肝臟和心血管等作用[3]。有研究表明干姜及其提取物姜精油、姜辣素乙醇提取物等具有很好的抑菌效果，其對銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等具有較明顯的抑制作用[4-9]。但目前國內(nèi)并未對干姜飲片的微生物限度檢查方法進行研究。本研究按照《中國藥典（2020 年版）》四部通則1107、1108 的要求探究中藥飲片干姜的微生物計數(shù)及控制菌的檢查方法，分析干姜飲片對不同菌株的抑制作用，為干姜飲品的品質(zhì)把控提供相關(guān)理論依據(jù)，同時可為含干姜的中成藥如透骨鎮(zhèn)風丸、定坤丹等的微生物檢查提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102] 和乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]均為定量質(zhì)控菌，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，經(jīng)菌種確認驗收合格。

1.2 試藥

干姜飲片購買于3 家不同連鎖藥店共3 批藥材，產(chǎn)地均為云南，編號1、2、3，具體信息見表1。

表1 3 批干姜飲片信息表

1.3 稀釋劑及培養(yǎng)基

pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、腸道增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基（MB）、RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MA）以及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，經(jīng)培養(yǎng)基適用性檢查驗收合格。

1.4 儀器與設(shè)備

101-3-BS 型鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；BKQ-B10011 型壓力蒸汽滅菌器，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSC-1300IIA2 型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；IC613CW 型恒溫培養(yǎng)箱，雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司。

1.5 方法

1.5.1 菌液制備

（1）接菌培養(yǎng)，制備新鮮的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌的培養(yǎng)物，取新鮮培養(yǎng)物分別用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行10 倍系列稀釋，制成含菌數(shù)約為104CFU·mL-1的菌懸液。

（2）取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入含0.05%（V/V）吐溫80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液3～5 mL，將孢子洗脫，并用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行10 倍系列稀釋，制成含孢子數(shù)約為104CFU·mL-1的孢子懸液。

1.5.2 供試液的制備

取供試品25 g，用無菌剪刀將其剪碎，置于滅菌三角瓶中，加滅菌TSB 至總體積為250 mL，充分振搖蕩洗（不少于15 min），取其液體作為1 ∶10 的供試液。取上述1 ∶10 供試液20 mL，置水浴100 ℃30 min處理后迅速冷卻，作為耐熱菌總數(shù)測定用供試液。

1.5.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

（1）需氧菌總數(shù)、耐熱菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗。試驗組：分別取1.5.2 項下制備的1 ∶10 供試液及耐熱菌總數(shù)測定用供試液9.9 mL，加入1.5.1 項下制備好的5 種試驗菌液0.1 mL，充分混勻，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 CFU。供試品對照組：分別取1∶10供試液及耐熱菌總數(shù)測定用供試液9.9 mL，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基0.1 mL 以代替菌液，充分混勻。菌液對照組：以胰酪大豆胨液體9.9 mL 替代供試液，加入1.5.1 項下制備好的5 種試驗菌液0.1 mL，充分混勻。采用傾注平皿法測定各菌的回收率，取“試驗組”的供試液2 mL，每1 mL 傾注于1 個滅菌平皿中。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌采用TSA 培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)3 d，白色念珠菌、黑曲霉采用TSA 培養(yǎng)基平板25 ℃培養(yǎng)5 d，計數(shù)。按相同方法測定供試品對照組的菌落數(shù)及菌液對照組的菌落數(shù)，以算術(shù)均值作為計數(shù)結(jié)果。按下列公式計算回收率（比值）。

（2）霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。采用傾注平皿法。取1.5.2 項下制備的1 ∶10 供試液9.9 mL，分別加入1.5.1 項下制備的白色念珠菌菌液0.1 mL 及黑曲霉孢子懸液0.1 mL，充分混勻。取上述混勻的供試液2 mL，每1 mL 傾注至1 個平皿，傾注SDA 培養(yǎng)基，待其凝固后25 ℃培養(yǎng)5 d，計數(shù)。供試品對照組的菌落數(shù)及菌液對照組的菌落數(shù)按同法操作測定，以算術(shù)均值作為計數(shù)結(jié)果，計算回收率。

1.5.4 控制菌檢查方法適用性試驗

（1）耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗）檢查方法適用性試驗。取1.5.2 項下1 ∶10 的供試液在20 ～25 ℃培養(yǎng)約2 h 后，取1 ∶10 供試液進行10 倍系列稀釋，稀釋成1 ∶100 和1 ∶1 000，取該3 個稀釋級樣品勻液1 mL，分別接種至10 mL 腸道菌增菌液中，并加入小于100 CFU 的銅綠假單胞菌菌液及大腸埃希菌菌液，作為試驗組。依次做陽性對照組和陰性對照組，各組置于35 ℃ 培養(yǎng)48 h，再取培養(yǎng)物劃線于XLD 平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，進行鑒定實驗。

（2）大腸埃希菌檢查方法適用性試驗。取10 mL 1.5.2 項下制備的1 ∶10 的供試液于100 mL TSB 中，并加入小于100 CFU 的大腸埃希菌菌液，充分混勻，作為試驗組，同時做陽性對照和陰性對照組。上述各組按《中國藥典（2020 年版）》四部通則1108 中控制菌檢查項下大腸埃希菌的檢查法進行后續(xù)試驗及鑒定。

（3）沙門菌檢查方法適用性試驗。取干姜飲片10 g，用無菌剪刀將其剪碎，加入至100 mL TSB 中，并加入小于100 CFU 的乙型副傷寒沙門菌，充分混勻，作為試驗組，同時做陽性對照和陰性對照組。上述各組按《中華人民共和國藥典（2020 年版）》四部通則1108 中控制菌檢查項下沙門菌的檢查法進行后續(xù)試驗及鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

2.1.1 需氧菌總數(shù)、耐熱菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

需氧菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗結(jié)果見表2，耐熱菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗結(jié)果見表3。實驗結(jié)果顯示，若采用1 ∶10 傾注平皿法測定需氧菌總數(shù)，銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌的回收率不能達到《中華人民共和國藥典（2020 年版）》四部0.5 ～2.0 的要求；采用1 ∶10 傾注平皿法進行耐熱菌總數(shù)的測定時，銅綠假單胞菌的回收率不能達到要求，故將供試液分別稀釋至1 ∶50 和1 ∶100 再次進行該項目的方法適用性試驗，結(jié)果見表4 及表5。結(jié)果顯示，采用1 ∶50 及1 ∶100 傾注平皿法時，各菌種回收率均能達到0.5～2.0的要求，故可采用1∶50傾注平皿法進行需氧菌總數(shù)及耐熱菌總數(shù)的計數(shù)。

表2 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗結(jié)果表

表3 耐熱菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗結(jié)果表

表4 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶50/1 ∶100）適用性試驗結(jié)果表

表5 耐熱菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶50/1 ∶100）適用性試驗結(jié)果表

2.1.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，霉菌和酵母菌總數(shù)的測定采用1 ∶10 傾注平皿法測定時，各試驗菌的回收率（比值）均在0.5 ～2.0，此方法可行。

表6 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法（1 ∶10）適用性試驗結(jié)果表

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

2.2.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗）檢查方法適用性試驗

耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗）檢查方法適用性試驗結(jié)果見表7。由表7 可知，采用10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基進行試驗時，銅綠假單胞菌試驗組未檢出，故此方法不可行。采用增加腸道菌增菌液體培養(yǎng)基的方法再次進行試驗，將該培養(yǎng)基體積增至15 mL，陰性對照組未檢出試驗菌，而試驗組及陽性對照組均可檢出，表明此方法可行。

表7 耐膽鹽革蘭陰性菌（定量試驗）檢查方法適用性試驗結(jié)果表

2.2.2 大腸埃希菌、沙門菌檢查方法適用性試驗

大腸埃希菌、沙門菌檢查方法的適用性試驗結(jié)果見表8。由表8 可知，采用100 mL TSB 培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)適用于大腸埃希菌的檢查，但沙門菌的檢查采用同體積TSB 時試驗組無法檢出沙門菌，故該法不適用于干姜飲片沙門菌的檢查。因而采用增加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的方法重新進行試驗。將10 g 干姜飲片用無菌剪刀將其剪碎，加入200 mL TSB 中進行沙門菌檢查方法適用性試驗。結(jié)果陰性對照組未檢出沙門菌，而試驗組及陽性對照組均可檢出此菌，表明使用200 mL TSB 培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)適用于干姜飲片沙門菌的檢查。

表8 大腸埃希菌、沙門菌檢查方法的適用性試驗結(jié)果表

綜上所述，采用1 ∶10 平皿法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)時，枯草芽孢桿菌的回收率以及銅綠假單胞菌的回收率不能達到要求，需稀釋至1 ∶50 才能滿足回收率0.5 ～2.0 的要求。采用1 ∶10 平皿法進行耐熱菌總數(shù)計數(shù)時，銅綠假單胞菌的回收率不能達到要求，需稀釋至1 ∶50 才能滿足要求。耐膽鹽革蘭陰性菌檢查使用10 mL 腸道增菌液時，銅綠假單胞菌試驗組無法檢出，需使用15 mL 腸道增菌液進行增菌培養(yǎng)。沙門菌檢查使用100 mL TSB 時試驗組無法檢出沙門菌，需增加該培養(yǎng)基至200 mL。因此，確定干姜飲片的微生物限度檢查方法如下。①需氧菌總數(shù)及耐熱菌總數(shù)計數(shù)采用1 ∶50 傾注平皿法。②采用1 ∶10 傾注平皿法進行霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。③耐膽鹽革蘭陰性菌分別取相當于0.1 g、0.01 g 和0.001 g 供試品的預培養(yǎng)物接種至15 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中進行檢查。④大腸埃希菌檢查取相當于1 g 供試品的供試液加入至100 mL TSB 中進行增菌培養(yǎng)。⑤沙門菌檢查將10 g 樣品加至200 mL TSB 中進行增菌培養(yǎng)。

2.3 干姜飲片的抑菌性分析

從本研究試驗結(jié)果可知，干姜飲片對銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌性，且對金黃色葡萄球菌也有一定的抑制作用。有文獻報道，新鮮生姜和干姜的精油對銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌等均有抑菌效果[[4-5]]，EL-BAROTY 等[6]發(fā)現(xiàn)，姜精油對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用。另有文獻報道，姜產(chǎn)品對上述3 種菌均有抑制作用[7]，這些研究結(jié)論與本實驗結(jié)果有相通之處，或可用于解釋干姜飲片對上述菌株的抑菌作用。干姜的抑菌作用可能源于其精油或姜辣素等成分的抑菌效果[8-9]。干姜對沙門菌的抑制作用[10]，在本研究中也得到了驗證。有研究表明，姜皮精油對大腸埃希菌具有抑制作用[11]，本實驗未發(fā)現(xiàn)干姜對大腸埃希菌有抑菌作用，考慮是按藥典的規(guī)定，檢測大腸埃希菌時加入的樣品量為1 g，該樣品量不足以對大腸埃希菌產(chǎn)生抑菌性。本實驗未發(fā)現(xiàn)干姜對白色念珠菌及黑曲霉有抑制作用。

3 結(jié)論

干姜飲片藥食兩用，應用廣泛。藥理學研究表明，干姜及其單體化學成分具有抗炎抑菌、抗氧化、抗癌、保護肝臟、心血管等作用[3]。本研究探究出了適合干姜飲片的微生物限度檢查方法，并在此基礎(chǔ)上分析了干姜飲片對不同菌株的抑制作用，這有益于干姜飲片的質(zhì)量控制，同時可為含干姜飲片的中成藥如透骨鎮(zhèn)風丸、定坤丹等的微生物限度檢查提供一定的參考。