白子譽, 酈尓啟, 劉 輝, 任長蓉, 鄭 彬, 孫啟天, 高英梅, 張井松, 李 劍

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院, 河北 承德 067000 2.河北省遷安市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 河北 遷安 063000)

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1],全球肝癌的年新發(fā)病率占全部癌癥的4.6%,死亡率高達8.3%,其主要亞型為肝細胞癌(HCC)[2]。HCC預后差,生存率低,5年生存率僅為18%,主要原因是HCC在早期癥狀不明顯,發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于中晚期,并且常規(guī)化療和放療對HCC治療效果欠佳[3]。因此,早期快速診斷HCC的生物標志物對于HCC早期治療,減少病死率非常重要。microRNA (miRNA) 廣泛存在于各種細胞中,是真核生物中一類長約20～25苷酸的內(nèi)個核源性非編碼小分子RNA,通過結合靶 mRNA 的 3' UTR 中的互補序列,在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達,參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明miR-342-3p在多種癌組織中表達,發(fā)揮抑癌作用。但miR-342-3p在HCC癌組織中表達情況及對HCC的診斷價值研究較少。miR-2116-3P是另一個在結腸癌和乳腺癌中起到抑癌作用的miRNA分子,其在HCC癌組織的表達情況未見報道。本研究通過對早期HCC癌組織miR-342-3p和miR-2116-3p的檢測,探討miR-342-3p和miR-2116-3p對早期HCC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年11月至2022年11月在承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科收治的57例HCC患者。其中男39例,女18例,年齡48～84歲,平均(61.65±7.43)歲。全部病例均經(jīng)病理診斷為HCC,按TNM進行分期(美國腫瘤聯(lián)合委員會(AJCC))?；颊咝g前均未進行任何放化療治療。已排除:①具有其他臟器功能不全患者;②合并其他癌癥患者;③具有精神類疾病。取手術后切除的癌組織及相應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>2cm)作為對照,組織標本置于液氮中保存。

1.2方 法

1.2.1RNA的提取:按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(購自北京天根科技有限公司)說明書進行操作。取300mg組織,剪成小塊,置于研缽內(nèi),加入液氮研磨成粉末。加入1mL裂解液,靜止5min,12000rpm離心10min,取上清后加入氯仿。12000rpm離心15min后取上清,吸入到新的離心管后,加入1/3體積無水乙醇,轉(zhuǎn)入吸附柱中,進行分離純化,用20LDEPC水洗脫得到RNA(含有miRNA)。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-342-3p和miR-2116-3p的表達水平:對miR-342-3p和miR-2116-3p進行擴增,反應體系均為20μL,反應條件為95℃預變性15min,70℃變性15s,60℃退火,進行40個循環(huán),以內(nèi)源性u6作為參照。miR-2116-3P、miR-342-3P以及u6的引物序列均購自廣州銳博生物科技有限公司,產(chǎn)品編號分別為MOPS0000823-1-100、MQPS0001090-1-100、MQPS0000000-2-100。PCR擴增儀購自美國MJ Research公司。

1.2.3隨訪:撥打電話或者醫(yī)院病例信息方式對患者進行2年隨訪,記錄患者治療后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復發(fā)的時間。

2 結 果

2.1miR-342-3p、miRNA-2116-3p在肝癌組織和癌旁組織中的表達:比較兩種miRNAs在肝癌組織和癌旁組織中的表達情況:miR-2116-3P表達在肝癌組織中明顯低于對照組,miR-342-3P在肝癌組織中表達水平也明顯低于對照組,差異具有顯著性(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 A:miR-2116-3p在肝癌組織(HCC)和癌旁組織(對照)中的表達情況;B:miR-342-3p在肝癌組織(HCC)和癌旁組織(對照)中的表達情況

表1 miR-2116-3p和miR-342-3p在肝癌組織(HCC)和癌旁組織(對照)中的表達情況(2-ΔΔCT)

2.2組織中miR-2116-3p和miR-342-3p對早期HCC的診斷價值:為了進一步分析miRNAs的診斷效能,我們建立了ROC曲線。研究結果顯示兩種miRNAs能夠很好的從對照組中鑒別HCC。miR-2116-3p和miR-342-3p鑒別HCC的ROC曲線下面積(Area under the curve,AUC)分別為0.694(95%CI0.597～0.791,P=0.049)和0.781(95%CI0.696～0.867,P=0.044),計算cutoff'值分別為0.85(靈敏性73.7%,特異性75.4%)和0.0003(靈敏性80.7%,特異性55.4%)兩組聯(lián)合從對照組中鑒別HCC的ROC曲線下面積為0.793(95%CI 0.711～0.879,P=0.042),見圖2。

圖2 組織中miR-2116-3p、miR-342-3p對HCC鑒別的ROC曲線

57例研究對象,45例病人AFP≤400,根據(jù)miR-2116-3P及miR-342-3P cutoff值對45例患者進行判斷,在這45例患者中,有29(64%)例是miR-2116-3P陽性(>cutoff值),有38(84%)例患者是miR-342-3P陽性(>cutoff值)。有42(93%)例患者是miR-2116-3P陽性或miR-342-3P陽性。見表2。

表2 miR-2116-3P及miR-342-3P對AFP<400ng/mL早期HCC患者的診斷

2.3組織中及miR-2116-3p含量與患者臨床病理參數(shù)的關系:以miR-2116-3p在肝癌組織中相對表達水平的中位數(shù)作為分組依據(jù),將57例肝癌患者分為兩組:低表達組(n=29)及高表達組(n=28)。比較不同組別患者臨床及病理資料。比較結果顯示兩組比較患者的年齡、性別、AFP高表達(>400ng/mL)及低表達(≤400ng/mL)人數(shù)、肝硬化人數(shù)、乙型肝炎病毒攜帶人數(shù)無顯著相關(P>0.05),miR-2116-3p高表達組與低表達組比較,腫瘤大小、TNM分期及CLIP評分有顯著差異(P=0.045、P=0.042和P=0.006)。提示miR-2116-3p與腫瘤大小、TNM分期及患者CLIP評分顯著相關。見表3。

表3 HCC組中miR-2116-3p表達與患者臨床病理參數(shù)的關系

2.4組織中及miR-342-3p含量與患者臨床病理參數(shù)的關系:以miR-342-3p在肝癌組織中相對表達水平的中位數(shù)作為分組依據(jù),將57例肝癌患者分為兩組:低表達組及高表達組。比較不同組別患者臨床及病理資料。比較結果顯示兩組比較患者的年齡、性別、AFP高表達(>400ng/mL)及低表達(≤400ng/mL)人數(shù)、肝硬化人數(shù)、乙型肝炎病毒攜帶人數(shù)無顯著相關(P>0.05),miR-342-3p高表達組與低表達組比較,腫瘤大小、TNM分期及CLIP評分有顯著差異(P<0.001、P=0.042和P=0.042)。提示miR-342-3p與腫瘤大小、TNM分期及患者CLIP評分顯著相關。見表4。

表4 HCC組中miR-342-3p表達與患者臨床病理參數(shù)的關系

2.5組織中miR-2116-3P、miR-342-3p的Kaplan-Meier生存分析:57例HCC患者術后隨訪,失訪8人,2年內(nèi)不良預后發(fā)生11人,預后良好38人,不良預后發(fā)生率為23%。不良預后分析函數(shù)顯示miR-2116-3p低表達組不良預后發(fā)生率高于miR-2116-3p高表達組(P=0.021)。miR-342-3p低表達組不良預后發(fā)生情況同miR-32-3p高表達組比較無顯著差異(P>0.05),見圖3。

圖3 miR-2116-3p(A)和miR-342-3p(B)與HCC患者不良預后的關系

2.6Cox回歸分析:單因素Cox回歸分析結果顯示:有無癌栓、CLIP評分、miR-2116-3p均是影響肝癌患者不良預后發(fā)生的危險因素,見表5。多因素Cox回歸分析結果顯示有無癌栓和miR-2116-3p可以作為預測HCC患者不良預后的獨立危險因素,見表6。

表5 單因素分析HCC患者不良預后影響因素

表6 多因素分析HCC患者不良預后影響因素

3 討 論

原發(fā)性肝癌作為人群中常見的癌癥類型,其惡性程度及病死率較高。導致肝癌的危險因素較多,包括乙肝病毒、丙肝病毒、脂肪肝疾病、酒精相關肝硬化、吸煙、肥胖、糖尿病、鐵過量和各種飲食暴露[4]。值得注意的是,乙型肝炎病毒感染是我國HCC發(fā)病的主要原因,由肝炎進展為肝硬化乃至HCC的過程涉及多種分子機制參與其中[5]。

miR在正常個體生長發(fā)育、維持體內(nèi)平衡狀態(tài),以及各項生理活動中起到不可缺少的作用。除此之外,miR還可以調(diào)控癌基因和抑癌基因的活性,進而對細胞癌變的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生直接的作用[6]。研究表明,多種惡性腫瘤中miR出現(xiàn)異常表達。例如miR-122、miR-21、miR-222、miR-223和miR-199均與HCC的發(fā)生和發(fā)展有關[7]。與正常肝組織相比,miR表達水平的變化在癌前發(fā)育不良結節(jié)中頻繁出現(xiàn),并貫穿HBV相關肝癌的整個發(fā)展過程,表明miR的表達變化發(fā)生在HBV感染-肝硬化-HCC過程[8]。為了尋找HCC的生物標志物,以提高診斷效率和個性化治療,此前大多數(shù)研究人員專注于全蛋白和多肽[9]。然而,與基于qPCR的分析相比,蛋白質(zhì)檢測方法由于其靈敏度相對較低且檢測過程過于復雜,因此在臨床應用中更加困難。研究還發(fā)現(xiàn)廣泛存在于各種細胞、組織中,血清或血漿中的miR具有高度的穩(wěn)定性和組織特異性[10],具有生物診斷標志物特性。

本研究的目的是評價miR-2116-3p和miR-342-3p對HCC的診斷及預后價值。我們對具有不同臨床特征的HCC患者的腫瘤組織和癌旁組織中的miR表達量進行了比較,結果顯示和癌旁對照組織相比,HCC組中miR-2116-3p和miR-342-3p均顯著降低,并且具有顯著性差異。進一步應用ROC曲線證明miR-2116-3p和miR-342-3p對HCC具有診斷價值。在本研究中AFP<400ng/mL患者45例,應用miR-2116-3p和miR-342-3p可以提高AFP<400ng/mL患者診斷率。聯(lián)合miR-2116-3p和miR-342-3p可以對45例AFP<400ng/mL患者進行診斷。miR-2116-3p和miR-342-3p是傳統(tǒng)指標AFP的有利補充。本研究中miR-342-3p表達量在癌組織中顯著下降和其他癌組織研究結果相一致,提示miR-342-3p具有抑癌作用。對miR-2116-3p和miR-342-3p與患者臨床及病理資料進行分析,顯示miR-2116-3p和miR-342-3p均分別和腫瘤大小、TNM分期及CLIP評分相關。

miR-342-3p參與眾多信號通路調(diào)節(jié),可能和HCC的發(fā)生發(fā)展相關,Zhao等[11]的研究發(fā)現(xiàn)miR-342-3p與NF-κB途徑相關,通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)NF-κB途徑下游基因被miR-342-3p下調(diào),被miR-342-3p-in上調(diào),證實了miR-342靶向NF-κB途徑。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-342-3p在體外和體內(nèi)抑制IGF-1R介導的PI3K/AKT/GLUT1信號通路,通過抑制糖酵解來抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。Ronja-Melinda Komoll等[13]的研究中,證實了單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(MCT1)是HCC中miR-342-3p的真正靶標,肝癌患者腫瘤中的miR-342-3p下調(diào),與MCT1表達呈負相關。結果提示miR-342-3p在調(diào)控肝癌中發(fā)揮作用。

本研究中miR-2116-3p在HCC組織中表達量顯著降低。盡管該miR與癌癥相關報道較少,但其預測的靶基因涉及癌癥。預測得分最高的四個預測靶點是ZDHHC11、MTCH2、DIRC2和PEA15[14]。近一半的非小細胞肺癌和膀胱癌患者的ZDHHC1基因拷貝數(shù)發(fā)生改變。MTCH2是一種與非惡性組織相比在腫瘤組織中表現(xiàn)出高度限制水平的基因表達變異的基因。Bodmer等[14]研將DIRC2鑒定為家族性腎細胞癌相關基因。PEA15的表達水平用于星形膠質(zhì)細胞腫瘤的惡性程度分級[15]。這些事實表明,miR-2116-3p可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

綜上所述,本研究結果表明,miR-342-3p和miR-2116-3P在肝癌組織相對表達量顯著低于健康組織,且其異常表達與肝癌患者腫瘤大小、TNM分期及CLIP評分相關。應用Kaplan-Meier及Cox分析顯示miR-2116-3p是HCC預后不良的獨立風險因素,而miR-342-3p無顯著預后價值。

miR-2116-3p和miR-342-3p作為新的診斷標準物,其診斷效能及預后評估價值需要大規(guī)模樣本進行進一步驗證,本實驗研究病例較少,隨訪時間短,對統(tǒng)計結果造成了一定影響。另外miR-2116-3p和miR-342-3p參與HCC發(fā)生發(fā)展的機制有待進一步研究。