王 歡, 夏 力, 李 瑋, 謝春鳳

(四川省綿陽市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頜面外科, 四川 綿陽 621000)

舌癌是一種惡性程度高、已發(fā)生早期遷移和侵襲的口腔癌之一,98%以上為鱗狀細(xì)胞癌。雖然手術(shù)治療提高了患者的存活率,但仍然很低。此外,手術(shù)對患者身體的傷害也很大。因此,有時(shí)有必要進(jìn)行放療和化療,以防止癌癥復(fù)發(fā)。促進(jìn)舌癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),是舌癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。因此,研究一些低損傷效應(yīng)的藥物和基因治療可以加強(qiáng)癌癥的預(yù)防和治療。黃芩苷(Bai)是一種芐基異喹啉生物堿,是中草藥黃芩的主要活性成分,已被證明在人類癌癥中具有抗增殖、抗炎和抗轉(zhuǎn)移作用[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),Bai抑制乳腺上皮細(xì)胞EMT過程,抑制乳腺癌的發(fā)生[3]。但是關(guān)于Bai在舌癌上的研究還尚未見人報(bào)道。Notch通路是研究舌癌的常見通路,下調(diào)Notch/JAG1信號軸可以抑制舌癌細(xì)胞EMT、遷移、侵襲,從而起到抗舌癌效果[4]。近期,人們發(fā)現(xiàn)Bai可以通過調(diào)節(jié)Notch通路抑制足細(xì)胞損傷[5]。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是首次研究了Bai對舌癌上的作用效果及其作用機(jī)制。本研究旨在探究Bai是否可以通過抑制Notch/JAG1信號通路對舌癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要材料:人舌磷癌細(xì)胞CAL27購自南京萬木春生物科技有限公司;人口腔上皮細(xì)胞HOEC購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司;Bai(HPLC≥98%)購自上海玉博生物科技有限公司;Notch/JAG1通路激活劑VPA購自北京百奧萊博科技有限公司;MTT細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒購自江西艾博因生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;E-cadherin兔抗一抗、vimentin兔抗一抗、Snail兔抗一抗、Notch1兔抗一抗、JAG1兔抗一抗、內(nèi)參蛋白GAPDH兔抗一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購自Abcam;酶標(biāo)儀(型號:EnVision)購自珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司;離心機(jī)(型號:Multifuge X4F)購自ThermoFisher公司;NovoCyte 流式細(xì)胞儀購自廣州柏賽柯生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng):將購買的CAL27和HOEC細(xì)胞均在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),并補(bǔ)充有10%胎牛血清、100U/mL青霉素-鏈霉素,培養(yǎng)基置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測Bai對HOEC細(xì)胞毒性的影響:收集HOEC細(xì)胞懸液稀釋至5×104個(gè)/mL,取20μL細(xì)胞懸液接種在96孔板上,培養(yǎng)1d后,細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)添加不同濃度的Bai(0、10、20、30、40、50和100μM)繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后在每孔中加入濃度為5mg/mL的MTT溶液25μL,室溫孵育4h后,加入100μL二甲基亞砜,充分震蕩后測量570nm處吸光度值。

1.4細(xì)胞分組:將CAL27細(xì)胞分為CAL27組(未處理的CAL27細(xì)胞)、L-Bai組(10μM Bai處理CAL27細(xì)胞)、M-Bai組(20μM Bai處理CAL27細(xì)胞)、H-Bai組(40μM Bai處理CAL27細(xì)胞)[6]、VPA組(8mM Notch/JAG1通路激活劑VPA處理CAL27細(xì)胞[7])、H-Bai+VPA組(40μM Bai和8mM VPA共同處理CAL27細(xì)胞),培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞,按照1.3的操作步驟檢測Bai對CAL27細(xì)胞活力的影響。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測CAL27細(xì)胞凋亡:收集用藥物處理的CAL27細(xì)胞,用冷卻的PBS洗滌兩次后,重新懸浮在結(jié)合緩沖液中,然后在室溫避光條件下用5μL的Annexin V-FITC孵育5min,加入5μL PI孵育15min,最后,用流式細(xì)胞儀分析各組CAL27細(xì)胞凋亡率。

1.6Transwell檢測CAL27細(xì)胞侵襲、遷移能力:將藥物處理過的各組CAL27細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸,用有基質(zhì)膠(侵襲)或不涂有基質(zhì)膠(遷移)的Transwell評估CAL27細(xì)胞侵襲、遷移能力,首先,用移液槍吸取100μL濃度為4×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液到Transwell上室,同時(shí)用移液槍吸取500μL DMEM培養(yǎng)基到Transwell下室,37℃下孵育24h后用棉簽去除膜上表面細(xì)胞,然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min,之后,將這些細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色10min。通過倒置顯微鏡以200倍放大倍率對侵襲、遷移細(xì)胞進(jìn)行成像,并手動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.7Western blot檢測EMT蛋白以及Notch/JAG1信號通路蛋白表達(dá):使用RIPA緩沖液從細(xì)胞中提取總蛋白,然后在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min。收集上清液,并使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì),然后通過電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%牛血清白蛋白封閉后,將膜與一抗在4℃孵育過夜,一抗為:E-cadherin(1∶2000)、vimentin、(1∶2000)、Snail(1∶1000)、Notch1(1∶1000)、JAG1(1∶2000)和GAPDH抗體(1∶2000),然后,用TBST洗滌后與HRP偶聯(lián)的二抗孵育,并使用ECL顯色試劑盒使目的條帶可視化后,用ImageJ分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1Bai對HOEC細(xì)胞毒性作用:0～100μM Bai對HOEC細(xì)胞無明顯毒性影響(P>0.05),見表1。

表1 Bai對HOEC細(xì)胞的毒性作用

2.2Bai對CAL27細(xì)胞活力的影響:與CAL27組相比,L-Bai組、M-Bai組、H-Bai組OD值依次顯著減小(P<0.05),Bai呈現(xiàn)劑量相關(guān)性,而VPA組OD值顯著增大(P<0.05);與H-Bai組相比,H-Bai+VPA組OD值顯著增大(P<0.05),見表2。

表2 各組CAL27細(xì)胞活力比較

2.3Bai對CAL27細(xì)胞凋亡的影響:與CAL27組相比,L-Bai組、M-Bai組、H-Bai組凋亡率依次顯著上升(P<0.05),Bai的處理效果呈現(xiàn)劑量依賴性,而VPA組凋亡率顯著下降(P<0.05);與H-Bai組相比,H-Bai+VPA組凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖1,表3。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CAL27細(xì)胞凋亡率

表3 Bai對CAL27細(xì)胞凋亡率的影響

2.4Bai對CAL27細(xì)胞遷移、侵襲的影響:與CAL27組相比,L-Bai組、M-Bai組、H-Bai組CAL27細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量依次顯著減少(P<0.05),且隨著Bai添加劑量的增加,細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量下降的更顯著,而VPA組CAL27細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05);與H-Bai組相比,H-Bai+VPA組CAL27細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量顯著上升(P<0.05),見圖2、表4。

表4 Bai對CAL27細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.5Bai對CAL27細(xì)胞EMT的影響:與CAL27組相比,L-Bai組、M-Bai組、H-Bai組CAL27細(xì)胞E-cadherin蛋白水平依次顯著升高(P<0.05),vimentin、Snail蛋白水平依次顯著降低(P<0.05),而VPA組CAL27細(xì)胞E-cadherin蛋白水平顯著減少(P<0.05),vimentin、Snail蛋白水平顯著增加(P<0.05);與H-Bai組相比,H-Bai+VPA組CAL27細(xì)胞E-cadherin蛋白水平顯著下降(P<0.05),vimentin、Snail蛋白水平顯著上升(P<0.05),見圖3、表5。

圖3 Western blot檢測CAL27細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 Bai對CAL27細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響

2.6Bai對CAL27細(xì)胞Notch/JAG1信號通路蛋白的影響:與CAL27組相比,L-Bai組、M-Bai組、H-Bai組Notch1、JAG1蛋白水平依次顯著下調(diào)(P<0.05),而VPA組Notch1、JAG1蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05);與H-Bai組相比,H-Bai+VPA組Notch1、JAG1蛋白水平顯著升高(P<0.05),見圖4、表6。

圖4 Western blot檢測CAL27細(xì)胞中Notch1、JAG1蛋白水平

表6 Bai對CAL27細(xì)胞中Notch1 JAG1蛋白水平的影響

3 討 論

Bai具有多種藥理作用,包括抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。Bai可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞EMT、遷移、侵襲,是臨床上治療結(jié)直腸癌的重要候選藥物[8]。本研究用Bai處理HOEC細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),0～100μM Bai對HOEC細(xì)胞無明顯毒性影響。表明Bai對正常細(xì)胞無明顯毒性作用。而Bai處理CAL27細(xì)胞后,CAL27細(xì)胞OD值顯著下降,凋亡率顯著升高,且Bai對舌癌細(xì)胞的作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性,表明Bai可抑制舌癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,從而抑制舌癌發(fā)展。

EMT被認(rèn)為是癌細(xì)胞發(fā)展的重要過程,在癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲過程中被激活。在EMT中,上皮細(xì)胞失去其上皮特征(如E-cadherin的下調(diào)),獲得間質(zhì)表型(如N-cadherin和vimentin的上調(diào)),并激活下游轉(zhuǎn)錄因子(如Snail、Slug、Twist)[9]。EMT使得癌細(xì)胞獲得遷移和侵入周圍基質(zhì)的能力,隨后通過血液和淋巴管擴(kuò)散到遠(yuǎn)處[10]。因此,抑制癌細(xì)胞EMT過程是治療癌癥的常見措施。本研究發(fā)現(xiàn),Bai處理后CAL27細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量、vimentin、Snail蛋白水平顯著下降,E-cadherin蛋白水平顯著升高,表明Bai可能通過升高CAL27細(xì)胞E-cadherin水平使上皮細(xì)胞保持上皮特征,阻止其獲得間質(zhì)表型,進(jìn)而抑制CAL27細(xì)胞擴(kuò)散到其它臨近組織。

Notch信號通路是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞間通信途徑,可調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊并參與器官發(fā)育和細(xì)胞內(nèi)平衡,當(dāng)Notch受體和配體JAG1相互作用時(shí),該途徑被激活[11]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn),下調(diào)Notch信號通路可以通過抑制EMT來抑制舌癌細(xì)胞遷移和侵襲。Liu等[13]也發(fā)現(xiàn),下調(diào)Notch通路,可以使N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)降低,E-cadherin表達(dá)增加,抑制舌癌細(xì)胞EMT進(jìn)程,進(jìn)而起到抗舌癌作用。本研究發(fā)現(xiàn),Bai處理CAL27細(xì)胞后,CAL27細(xì)胞Notch1、JAG1蛋白水平顯著下降,表明Bai可能通過下調(diào)Notch/JAG1信號軸來發(fā)揮抑制舌癌發(fā)展的作用。為了進(jìn)一步證實(shí)猜測,我們用Notch/JAG1信號通路激活劑VPA處理CAL27細(xì)胞以及40μM Bai處理的CAL27細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPA的作用效果與Bai的作用效果相反,且VPA逆轉(zhuǎn)了Bai對CAL27細(xì)胞的抑癌效果。

綜上所述,Bai可能通過抑制Notch/JAG1信號傳導(dǎo)抑制CAL27細(xì)胞EMT過程,進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移和侵襲,從而起到抗舌癌的效果。且在本研究中,Bai對CAL27細(xì)胞的影響效果呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。本文的不足是缺少臨床研究,我們將在接下來的研究中深入探索。