陳燕枝

(江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室, 江西 上饒 333400)

三陰性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)是一種不表達(dá)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)的特定乳腺癌亞型,由于具有高異質(zhì)性,侵襲性并缺乏治療選擇,TNBC患者的生存時(shí)間更短,5年生存率比雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌低8～16%,且預(yù)后較差[1]。因此,需要尋找新的分子靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)治療TNBC。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移在很大程度上依賴于血管生成[2]。腫瘤血管生成是指從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)中形成新血管,而這一過(guò)程可為增殖和轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。血管生成抑制劑已成為許多實(shí)體瘤的有效治療策略,如抗血管形成藥物bevacizumab已被證實(shí)對(duì)TNBC治療有效[3]。因此,深入探討TNBC血管生成的分子機(jī)制對(duì)TNBC的治療具有重要意義。細(xì)胞分裂周期25B(cell division cyclin25 B,CDC25B)在許多原發(fā)性腫瘤中過(guò)度表達(dá),包括乳腺癌[4]、結(jié)直腸癌[5]和食管鱗狀細(xì)胞癌[6]等。如在子宮內(nèi)膜癌中,miR-152通過(guò)抑制CDC25B的表達(dá),誘導(dǎo)G2/M期阻滯,從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。目前關(guān)于CDC25B影響TNBC血管生成的研究尚未有報(bào)道,因此,本研究將進(jìn)一步探究CDC25B對(duì)TNBC血管生成的影響及其作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)CDC25B在TNBC中顯著上調(diào)表達(dá)并參與調(diào)控VEGF通路,沉默CDC25B能夠抑制TNBC血管生成。此外,miR-141-3p靶向負(fù)調(diào)節(jié)CDC25B的表達(dá),進(jìn)而抑制VEGF通路抑制TNBC血管生成。本文闡明了miR-141-3p/CDC25B/VEGF軸在TNBC血管生成過(guò)程中的調(diào)控作用及分子機(jī)制,為靶向TNBC血管生成提供了潛在的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1生信分析:從TCGA中下載乳腺癌mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)(Normal:41,Tumor:473),利用'edgeR'包對(duì)mRNA進(jìn)行normal組和tumor組的差異分析(|logFC|>1.5,FDR<0.05)獲得DEmRNA,通過(guò)文獻(xiàn)引證確定研究的目標(biāo)基因CDC25B。利用starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)乳腺癌中目標(biāo)基因上游的調(diào)控miRNA,通過(guò)Pearson相關(guān)性確定研究對(duì)象為miR-141-3p。利用GSEA軟件對(duì)CDC25B基因進(jìn)行通路富集分析。

1.2細(xì)胞培養(yǎng):從ATCC(美國(guó))購(gòu)入293T、人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、人TNBC細(xì)胞系(BT-549、MDA-MB-468、MDA-MB-231)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC。上述所有細(xì)胞系均在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為37℃,含5%CO2。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:miR-mimic(miR-141-3p mimic)si-CDC25B、oe-CDC25B及其陰性對(duì)照mimic-NC、si-NC和oe-NC均購(gòu)自Ribobio(China)。根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)將上述載體轉(zhuǎn)染到TNBC細(xì)胞中。

1.4細(xì)胞增殖檢測(cè):用Cell Counting Kit-8(CCK-8)進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)。將細(xì)胞以4×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h。分別在0d、1d、2d、3d和4d后,將CCK-8溶液添加到細(xì)胞中,并在450nm處對(duì)每個(gè)孔中細(xì)胞的吸光度進(jìn)行測(cè)定。

1.5HUVEC血管形成試驗(yàn):將50μL未稀釋的基質(zhì)凝膠(Corning,USA)加入96孔板中培養(yǎng)30min。然后,將1×104個(gè)HUVEC細(xì)胞添加到Matrigel預(yù)涂層的96孔板中,并與來(lái)自轉(zhuǎn)染成功的TNBC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)孵育。6h后對(duì)小管進(jìn)行觀察并拍照。

1.6qRT-PCR:通過(guò)TRIZOL試劑(Invitrogen,USA)從細(xì)胞系中提取總RNA,用MultiScribeReverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific,USA)進(jìn)行cDNA合成,并使用SYBR Green Real-Time PCR assay kit (Thermo Fisher Scientific,USA)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè),qRT-PCR在ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems,USA)上進(jìn)行。U6和β-actin分別作為miR-141-3p和CDC25B的內(nèi)參基因,通過(guò)2-ΔΔCT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7Western blot實(shí)驗(yàn):從TNBC細(xì)胞中提取的總蛋白樣品在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離,隨后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用5%脫脂牛奶封閉細(xì)胞1h,并用一抗在4℃孵育過(guò)夜,然后用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育2h。通過(guò)ECL試劑盒(Pierce Biotechnology,USA)檢測(cè)蛋白條帶,并在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上成像。本文所用的一抗包括:兔抗β-actin,兔抗CDC25B,兔抗VEGFA,兔抗VEGFR-2和兔抗VEGFR-3。

1.8雙熒光素酶報(bào)告分析實(shí)驗(yàn):構(gòu)建了包含miR-141-3p結(jié)合位點(diǎn)的CDC25B野生型(WT)或突變型(MUT)雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將上述質(zhì)粒與miR-mimic和mimic-NC共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。培養(yǎng)48h后,用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega,USA)測(cè)定熒光素酶的活性。

1.9數(shù)據(jù)分析:統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 8.0版本進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。組間差異的P值由兩組比較的Student's t檢驗(yàn)或多組比較的單因素方差分析確定。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CDC25B在TNBC中上調(diào)表達(dá):首先,基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)CDC25B在TNBC腫瘤組織中顯著上調(diào)(圖1A)。隨后,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了TNBC細(xì)胞系(BT-549、MDA-MB-468、MDA-MB-231)中CDC25B的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)CDC25B在TNBC細(xì)胞系中的表達(dá)水平相較于人正常乳腺癌上皮細(xì)胞系(MCF-10A)顯著升高(圖1B-C)。進(jìn)一步通過(guò)GSEA分析發(fā)現(xiàn)CDC25B顯著調(diào)控VEGF SIGNALING PATHWAY通路(圖1D)。

圖1 CDC25B在TNBC中上調(diào)表達(dá)

2.2CDC25B通過(guò)調(diào)控VEGF通路促進(jìn)TNBC血管生成:為了闡明CDC25B在TNBC血管生成中的潛在作用,將si-NC/si-CDC25B和oe-NC/oe-CDC25B分別轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn),相較于si-NC組,si-CDC25B組細(xì)胞中的CDC25B的表達(dá)顯著降低(圖2A,E),而相較于oe-NC組,oe-CDC25B組細(xì)胞中的CDC25B的表達(dá)顯著升高。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,si-CDC25B組細(xì)胞的增殖水平明顯下降,而oe-CDC25B組細(xì)胞的增殖水平明顯上升(圖2B)。為了確定CDC25B是否參與TNBC血管生成,我們將HUVEC細(xì)胞與轉(zhuǎn)染si-NC/si-CDC25B和oe-NC/oe-CDC25B的TNBC細(xì)胞條件培養(yǎng)基共孵育。血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CDC25B的沉默表達(dá)顯著抑制了HUVEC細(xì)胞的血管形成,而過(guò)表達(dá)CDC25B則明顯促進(jìn)了HUVEC細(xì)胞的血管形成(圖2C-D)。與此同時(shí),沉默CDC25B明顯抑制了血管生成因子VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表達(dá),而過(guò)表達(dá)CDC25B得到相反的結(jié)果(圖2E)。上述研究結(jié)果表明CDC25B可以在TNBC進(jìn)展過(guò)程中促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的血管生成。

圖2 CDC25B通過(guò)調(diào)控VEGF通路促進(jìn)TNBC血管生成

2.3miR-141-3p靶向下調(diào)CDC25B的表達(dá):為了探索CDC25B在TNBC中促血管生成功能的分子機(jī)制,我們利用starbase數(shù)據(jù)庫(kù)尋找CDC25B的上游潛在調(diào)控miRNA,與差異上調(diào)基因取交集共得到3個(gè)差異的miRNA(圖3A)。利用Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CDC25B與miR-141-3p的顯著負(fù)相關(guān)(圖3B),且miR-141-3p在TNBC腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)(圖3C)。此外,生信數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-141-3p與CDC25B存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖3D)。為進(jìn)一步驗(yàn)證生信的結(jié)果,qRT-PCR分析結(jié)果顯示miR-141-3p在TNBC細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)(圖3E)。隨后,雙熒光素酶報(bào)告分析發(fā)現(xiàn),miR-mimic可以降低293T細(xì)胞中野生型CDC25B的熒光素酶活性,(圖3F)。此外,過(guò)表達(dá)miR-141-3p后CDC25B的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖3G-H)。上述結(jié)果表明,miR-141-3p靶向下調(diào)CDC25B的表達(dá)。

圖3 miR-141-3p靶向下調(diào)CDC25B的表達(dá)

2.4miR-141-3p通過(guò)靶向CDC25B調(diào)節(jié)VEGF通路抑制TNBC血管生成:為了闡明miR-141-3p/CDC25B在TNBC血管生成中的作用,我們?cè)O(shè)置了回復(fù)實(shí)驗(yàn),將mimic-NC+oe-NC、miR-mimic+oe-NC和 miR-mimic+oe-CDC25B轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中。我們發(fā)現(xiàn),與mimic-NC+oe-NC組相比,miR-mimic+oe-NC組細(xì)胞中CDC25B的表達(dá)顯著下調(diào),而miR-mimic+oe-CDC25B組細(xì)胞中CDC25B的表達(dá)得到部分回復(fù)(圖4A,E)。CCK-8分析結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-141-3p顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力,而進(jìn)一步過(guò)表達(dá)CDC25B逆轉(zhuǎn)了miR-141-3p對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用(圖4B)。血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-141-3p過(guò)表達(dá)顯著抑制了HUVEC細(xì)胞的管形成能力,而進(jìn)一步過(guò)表達(dá)CDC25B逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果(圖4C-D)。Western blot結(jié)果顯示,miR-141-3p過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)了VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表達(dá),而TmiR-141-3p過(guò)表達(dá)的同時(shí)過(guò)表達(dá)CDC25B使這些蛋白的表達(dá)回復(fù)到對(duì)照組水平(圖4E)。這些結(jié)果表明,miR-141-3p通過(guò)靶向CDC25B抑制VEGF通路活性,進(jìn)而抑制TNBC血管生成。

圖4 miR-141-3p通過(guò)靶向CDC25B調(diào)節(jié)VEGF通路抑制TNBC血管生成

3 討 論

研究表明,腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移在很大程度上依賴于血管生成。腫瘤血管生成是指從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)中形成新血管,而這一過(guò)程可為增殖和轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。近年來(lái),腫瘤血管生成過(guò)程的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注,血管生成抑制劑已成為許多實(shí)體瘤的有效治療策略[7]?？寡苌伤幬镏饕峭ㄟ^(guò)阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/VEGF受體(VEGFR)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)破壞血管供應(yīng)并使腫瘤缺乏營(yíng)養(yǎng)和氧氣[8]。截至目前,FDA已批準(zhǔn)上市多種靶向血管生成信號(hào)通路的藥物,并在臨床抗腫瘤治療中顯示出良好的益處[9]。考慮到血管生成對(duì)TNBC的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后至關(guān)重要,探究參與調(diào)節(jié)TNBC血管生成的分子機(jī)制有助于為開(kāi)發(fā)新型有效的抗血管生成策略提供支持。本研究的結(jié)果表明CDC25B在TNBC中具有顯著的促血管生成作用,CDC25B可能是TNBC治療的潛在治療靶點(diǎn)。

CDC25B是G2/M細(xì)胞周期進(jìn)展的關(guān)鍵參與者。最近,CDC25B在腫瘤進(jìn)展中致癌特性被諸多報(bào)道。如在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中,METTL3增強(qiáng)CDC25B的m6A修飾,促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌惡性進(jìn)展[10]。在TNBC中,microRNA-211靶向負(fù)調(diào)節(jié)CDC25B表達(dá)抑制TNBC細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[11]。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)CDC25B在TNBC中顯著高表達(dá),過(guò)表達(dá)CDC25B可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖。此外,據(jù)報(bào)道METTL3增強(qiáng)了CDC25B mRNA的m6A修飾,從而保持其穩(wěn)定性并上調(diào)其表達(dá),從而激活細(xì)胞周期的G2/M期并促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成[11]。本研究中,CDC25B高表達(dá)富集在VEGF通路上。沉默CDC25B可以降低VEGFA、VEGFR-2和VEGFR-3的表達(dá),進(jìn)而抑制TNBC中內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力。在腫瘤中,VEGF與在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的VEGFR結(jié)合,從而積極調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程[12]。因此,目前靶向VEGF信號(hào)通路的療法被認(rèn)為在阻斷癌癥血管生成中是極其重要的。這些結(jié)果表明CDC25B是調(diào)節(jié)VEGF通路的關(guān)鍵介質(zhì),提示其可能是阻斷腫瘤血管生成的潛在治療靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步明確CDC25B在TMBC血管生成中的分子作用機(jī)制。通過(guò)生信分析發(fā)現(xiàn)CDC25B存在上游調(diào)控分子miR-141-3p,miR-141-3p可以靶向抑制CDC2B的表達(dá)。miR-141-3p已被報(bào)道與多種癌癥的惡性進(jìn)展有關(guān),在乳腺癌和乳頭狀甲狀腺癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用。一項(xiàng)研究報(bào)道,miR-141-3p通過(guò)靶向TRAF5抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究中,miR-141-3p在TNBC中低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-141-3p可以抑制TNBC細(xì)胞增殖,這與Li W等的研究結(jié)果一致。除此之外,本研究還發(fā)現(xiàn)miR-141-3p可以靶向CDC25B抑制VEGF通路的活性和降低VEGFA、VEGFR2和VEGFR-3的表達(dá),進(jìn)而抑制TNBC血管生成。總之,這項(xiàng)研究首次揭示了miR-141-3p/CDC25B軸在TNBC血管血管生成中功能及其調(diào)控機(jī)制,為TNBC抗血管生成療法提供了潛在的靶點(diǎn)。

綜上所述,本研究證實(shí)CDC25B在TNBC中顯著高表達(dá),且通過(guò)介導(dǎo)VEGF信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)TNBC血管生成。從機(jī)制上講,CDC25B受到上游調(diào)控分子miR-141-3p的調(diào)控,miR-141-3p靶向抑制CDC25B的表達(dá)并通過(guò)抑制VEGF途徑抑制TNBC血管生成。盡管本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)揭示了miR-141-3p/CDC25B/VEGF通路抑制TNBC血管生成的機(jī)制,但仍存在不足之處,未來(lái)尚需進(jìn)一步通過(guò)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外,該通路是否參與調(diào)控TNBC其他惡性過(guò)程有待進(jìn)一步探究?？傊?本研究結(jié)果表明miR-141-3p/CDC25B/VEGF通路是抑制TNBC血管生成的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制,這可能為TNBC抗血管生成治療提供新途徑。