康麗麗, 陳昭偉, 宋 健

(海南省腫瘤醫(yī)院, 海南 ?？?570123)

美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)公布的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,人類結(jié)腸癌的發(fā)病率為10.2%,死亡率已達(dá)到9.2%,從第四位上升到第二位[1],是消化系統(tǒng)中最常見的癌癥之一。通常,腫瘤切除適用于結(jié)腸癌的早期階段,化療藥物的組合通常用于不同階段的結(jié)腸癌患者,特別是在晚期[2]。隨著癌癥治療的發(fā)展,特別是免疫治療和靶向治療癌癥患者的總生存率有所提高[3]。然而,并非所有癌癥患者都能從這些治療中受益,為了解決這個(gè)問(wèn)題,許多研究還探索了一系列分子特征,如基因組特征[4]和生物標(biāo)志物[5],用于預(yù)測(cè)對(duì)治療的反應(yīng),從而指導(dǎo)個(gè)性化治療。MicroRNA是一類由19-22個(gè)核苷酸組成的小非編碼RNA,作為mRNA翻譯效率的負(fù)介質(zhì)參與幾乎所有細(xì)胞過(guò)程,轉(zhuǎn)錄后的MicroRNA通過(guò)結(jié)合靶mRNA的3,非翻譯區(qū)(3,-UTR)中的序列來(lái)降低靶基因表達(dá)[6]。miRNA的調(diào)控功能已在細(xì)胞增殖、遷移、分化和侵襲等各種細(xì)胞過(guò)程中被發(fā)現(xiàn),新興研究報(bào)道,功能性miRNA可直接作為抑癌基因或促癌基因,從而調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展[7]。腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遷移取決于血管生成,血管生成為腫瘤細(xì)胞提供足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)。因此,血管生成抑制劑開啟了癌癥治療的新時(shí)代,近年來(lái),已被廣泛接受為一種臨床治療策略。本研究探討了miR-891a-5p作為潛在血管生成因子在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。本研究考察了miR-891a-5p在結(jié)腸癌患者組織樣本以及結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平,并確定了miR-891a-5p的診斷和預(yù)后價(jià)值。此外,利用體外實(shí)驗(yàn)研究了miR-891a-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及血管生成的影響,并通過(guò)分析潛在的靶基因初步確定了miR-891a-5p在結(jié)腸癌發(fā)展中的潛在機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床樣本采集:患者從海南省腫瘤醫(yī)院2021年5月至2022年4月就診的36例患者中收集了結(jié)腸癌組織和鄰近正常組織(距離腫瘤邊緣至少3cm),所有收集的組織均儲(chǔ)存在-80℃以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。事先簽署患者知情同意書,并取得海南省腫瘤醫(yī)院研究所研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480,HCT8,HCT116和SW620)和正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞(FHC)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。所有細(xì)胞均在Dulbecco的改良Eagles培養(yǎng)基中孵育,并補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)在37℃的含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。使用Lipofectamine2000檢測(cè)試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞,僅用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作空白對(duì)照組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染在37℃下進(jìn)行6h,然后更換培養(yǎng)基,并在轉(zhuǎn)染后48h將細(xì)胞用于后續(xù)分析。

1.3CCK-8:將細(xì)胞接種到96孔板(2×103細(xì)胞/孔)并孵育0h、24h、48h和72h。然后,向每個(gè)孔中加入10μL lCCK-8試劑,并進(jìn)一步孵育2h。使用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)量光密度。

1.4管形成測(cè)定:將50μL基質(zhì)膠接種在96孔培養(yǎng)板中,然后在37℃下孵育。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)在具有不同外泌體或其他處理的基質(zhì)膠上培養(yǎng)。在37℃孵育4h后,在顯微鏡下觀察管的形成,并通過(guò)測(cè)量累積管長(zhǎng)度進(jìn)行分析。

1.5RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR):使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。使用qPCR和SYBR-GreenI預(yù)混液試劑盒在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)。U6用作miR-891a-5p的內(nèi)源性對(duì)照,GAPDH用作NLRP7的內(nèi)源性對(duì)照。熱循環(huán)條件如下:初始變性在95℃下變性10min,然后在95℃下變性40個(gè)循環(huán)30s,在60℃退火20s,在72℃下延伸15s,最終表達(dá)式值是使用2-ΔΔCt方法。見表1。

表1 引物序列表

1.6傷口愈合試驗(yàn):細(xì)胞(1×105細(xì)胞/mL)在處理24h后接種在24孔板中,并孵育至70%-80%匯合。使用無(wú)菌移液器吸頭,通過(guò)刮擦細(xì)胞單層產(chǎn)生劃痕傷口。加入新鮮培養(yǎng)基,將細(xì)胞再孵育24h或不孵育,細(xì)胞在倒置顯微鏡下成像。

1.7Transwell:Transwell室在37℃下預(yù)包被基質(zhì)膠1h用于侵襲測(cè)定,而沒(méi)有基質(zhì)膠涂層的室用于遷移測(cè)定。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度為2×105細(xì)胞/腔室用無(wú)血清培養(yǎng)基接種到上室中,同時(shí)將補(bǔ)充有10%FBS的培養(yǎng)基添加到下室中,作為化學(xué)引誘劑。在37℃孵育48h后,將下室中的細(xì)胞在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20min,并在倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.8靶基因預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè):TargetScan在線工具(http://www.targetscan.org/vert_72)預(yù)測(cè)miR-891a-5p潛在的靶基因。為了確認(rèn)miR-891a-5p和NLRP7在SW480細(xì)胞中的相互作用,將SW480細(xì)胞按照4×104細(xì)胞/孔接種到六孔板中,并在37℃下培養(yǎng)24h。隨后,將SW480細(xì)胞的野生型(WT)和突變型(MUT)3'-UTR克隆到熒光素酶報(bào)告載體PsiCheck2中。MUT序列是使用定點(diǎn)誘變?cè)噭┖猩傻?。根?jù)制造商的方案,將WT和MUT SW480細(xì)胞熒光素酶質(zhì)粒(100ng)與miR-891a-5p mimic(50nM)和相應(yīng)的NC共轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞中。在37℃孵育48h后,使用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性,螢火蟲熒光素酶活性被標(biāo)準(zhǔn)化為雷尼拉螢光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1miR-891a-5p在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平:miR-891-5a在結(jié)腸癌組織樣本中的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組或鄰近正常對(duì)照組,如圖1A所示,還發(fā)現(xiàn)miR-891a-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480,HCT8,HCT116和SW620)中的表達(dá)水平顯著高于正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞(FHC)(F=25.29,P<0.01),miR-891a-5p在SW480中表達(dá)最高,因此挑選SW480為后續(xù)研究,如圖1B所示,在測(cè)定miR-891a-5p在SW480細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的含量時(shí),發(fā)現(xiàn)miR-891a-5p在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)高于細(xì)胞核中的表達(dá)量,如圖1C所示。

圖1 miR-891a-5p在結(jié)腸癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-891a-5p對(duì)SW480細(xì)胞增殖、侵襲及遷移作用:miR-891a-5p mimic和miR-891a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染后,miR-891a-5p的mRNA表達(dá)水平分別在SW480細(xì)胞系中成功過(guò)表達(dá)和沉默(F=26.30,P<0.01),如圖2A所示,之后,使用CCK-8測(cè)定,轉(zhuǎn)染miR-891a-5p mimic的細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力顯著增加,但與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-891a-5p inhibitor的細(xì)胞增殖(F=28.93,P<0.01)、侵襲(F=21.24,P<0.01)及遷移(F=22.68,P<0.01)能力顯著降低。

2.3miR-891a-5p對(duì)SW480細(xì)胞血管生成的影響:圖3A結(jié)果表明,與Control比較miR-891a-5p mimic的血管生成數(shù)量明顯增加,而miR-891a-5p inhibitor的血管生成數(shù)量明顯降低(F=25.67,P<0.01),為驗(yàn)證HUVEC管形成實(shí)驗(yàn)的可靠性,使用Western blot對(duì)血管生成因子的相關(guān)蛋白VEGF和MMP-9進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),VEGF和MMP-9在miR-891a-5p mimic組蛋白表達(dá)水平顯著增加,蛋白表達(dá)水平在miR-891a-5p inhibitor明顯降低(F=20.36,P<0.01)。

圖3 miR-891a-5p對(duì)SW480細(xì)胞血管生成的影響

圖4 NLRP7是miR-891a-5p下游靶點(diǎn)基因

2.4NLRP7是SW480細(xì)胞中miR-891a-5p的直接靶標(biāo):根據(jù)starBase v2.0網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/)在線分析的結(jié)果,預(yù)測(cè)NLRP7是miR-891a-5p的靶標(biāo),在其3′-UTR,在NLRP7基因中發(fā)現(xiàn)了miR-891a-5p的結(jié)合位點(diǎn),并利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-891a-5p與NLRP7之間的相互作用。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明,NLRP7-WT組中的熒光素酶活性因miR-891a-5p的表達(dá)水平上調(diào)而降低,然而,MUT組的熒光素酶活性沒(méi)有顯著變化(t=1.31,P=0.26)。NLRP7的表達(dá)水平在結(jié)腸癌患者腫瘤組織中明顯低于鄰近正常組織(t=10.08,P<0.001),與miR-891a-5p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),上述結(jié)果表明,NLRP7可能是結(jié)腸癌中miR-891a-5p的直接靶標(biāo)。

2.5NLRP7過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的作用:NLRP7作為miR-891a-5p的靶向目標(biāo),與OE-NC組相比,OE-NLRP7組中NLRP7表達(dá)水平顯著增加(t=18.12,P<0.01),表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功,如圖5A所示,而且OE-NLRP7組的細(xì)胞增殖(t=20.17,P<0.01)、侵襲(t=23.15,P<0.01)及遷移(t=19.64,P<0.01)能力明顯下降。

圖5 NLRP7過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌增殖、侵襲及遷移的作用

2.6NLRP7過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞血管生成的影響:Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VEGF(t=13.88,P<0.01)和MMP-9(t=15.67,P<0.01)蛋白表達(dá)水平在OE-NLRP7顯著降低。圖6B結(jié)果表明,與OE-NC比較OE-NLRP7的血管生成數(shù)量明顯降低(t=20.17,P<0.01)。

圖6 NLRP7過(guò)表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞血管生成的影響

3 討 論

結(jié)腸癌發(fā)展的基礎(chǔ)機(jī)制為各種基因的轉(zhuǎn)錄和多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的協(xié)同過(guò)程。盡管已有許多研究探索了結(jié)腸癌發(fā)展的分子機(jī)制,但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。研究表明miRNA的異常表達(dá)已被確定與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),據(jù)報(bào)道,它們通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)參與細(xì)胞凋亡,增殖,細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)移[8]。miRNA已被鑒定為腫瘤發(fā)生中的癌基因或抑癌基因,侵襲和遷移是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)行為,與預(yù)后不良密切相關(guān),嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。因此,深入分析遷移機(jī)制對(duì)提高結(jié)腸癌患者的生存率和預(yù)后具有重要意義。據(jù)報(bào)道,miR-891a-5p在許多癌癥中具有促進(jìn)癌癥的功能[9],本研究使用36份結(jié)腸癌組織和鄰近正常組織檢測(cè)miR-891a-5p表達(dá)水平,我們的結(jié)果表明,結(jié)腸癌患者標(biāo)本中的miR-891a-5p顯著增加?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是侵襲和破壞細(xì)胞外基質(zhì)所必需的,可促進(jìn)癌細(xì)胞向附近健康組織的侵入性進(jìn)展[10],在惡性腫瘤的侵襲性,遷移性和血管生成進(jìn)展中具有不可或缺的地位。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是重要的促血管生成的生長(zhǎng)因子,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有有絲分裂和抗凋亡作用,增加血管通透性,促進(jìn)細(xì)胞遷移等[11],遷移的開始不僅僅是細(xì)胞自主事件,而是受到復(fù)雜組織微環(huán)境的影響,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以被癌細(xì)胞分泌的乳酸刺激以促進(jìn)血管生成,微環(huán)境對(duì)癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響既是細(xì)胞自主的,也是組織環(huán)境依賴性的,這進(jìn)一步增加了這一過(guò)程的復(fù)雜性?？偠灾?miR-891a-5p的下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移、增殖和侵襲受到抑制,但miR-891a-5p的上調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為增強(qiáng)。

本研究中,在NLRP7的3'UTR中發(fā)現(xiàn)了miR-891a-5p的互補(bǔ)序列,我們使用熒光素酶活性測(cè)定證明了miR-891a-5p與NLRP7的相互作用。此外,結(jié)腸癌患者miR-891a-5p與NLRP7 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。先前報(bào)道的關(guān)于NLRP7在結(jié)腸癌中的功能作用的研究,結(jié)合我們的數(shù)據(jù)啟發(fā)我們推斷miR-891a-5p可能通過(guò)靶向NLRP7參與結(jié)腸癌進(jìn)展的調(diào)節(jié)。miR-891a-5p在結(jié)腸癌進(jìn)展中的確切分子機(jī)制尚未深入探索,這是本研究的局限性,值得進(jìn)一步研究。

NLR家族成員的重要作用是直接或間接促成癌癥發(fā)展,包括炎癥、細(xì)胞死亡、腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。在功能方面,一些成員可能是炎癥小體途徑的啟動(dòng)者,其規(guī)范激活半胱天冬酶-1,此后激活I(lǐng)L-1β和IL-18[13],在NLR家族的所有成員中,NLRP7及其功能知之甚少。最近報(bào)道了NLRP7基因與潰瘍性結(jié)腸炎(UC)之間的相關(guān)性,并且發(fā)現(xiàn)NLRP7表達(dá)在炎癥性腸病患者的腸黏膜中上調(diào)[14]?？紤]到炎癥性腸病患者發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)過(guò)高,且NLRP7在癌癥中的功能尚不清楚,我們結(jié)果證實(shí),NLRP7可能在結(jié)腸癌進(jìn)展中起到抑制作用,這與其他人的研究結(jié)果并不一致,因此其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

但是本研究有幾個(gè)局限性,例如樣本量有限,缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。此外,未研究甲基化等其他因素對(duì)NLRP7表達(dá)水平的影響,這可能干擾miR-891a-5p對(duì)NLRP7的調(diào)節(jié)。因此,在未來(lái)的研究中,可利用動(dòng)物癌癥模型進(jìn)一步研究miR-891a-5p在結(jié)腸癌發(fā)生中的功能作用和機(jī)制,以及miRNA 891a-5p/NLRP7軸的具體調(diào)控機(jī)制。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,miR-891a-5p在結(jié)腸癌組織的表達(dá)增加,可作為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。miR-891a-5p過(guò)表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及血管生成能力,表明miR-891a-5p可能是結(jié)腸癌進(jìn)展中的癌基因,對(duì)結(jié)腸癌的治療具有靶向潛力。NLRP7也被確定為miR-891a-5p的靶基因,可能介導(dǎo)miR-891a-5p在結(jié)腸癌進(jìn)展中的生物學(xué)功能。